• D. Meričko, J. Lehotay, J. Čižmárik
  • Vplyv zloženia mobilnej fázy na separáciu a termodynamické parametre enantioseparácie chirálnych sulfoxidov pri použití chirálnej stacionárnej fázy CHIROBIOTIC TAG
  • Farm Obz, 79, 2010, 7-8, s 167-176

Chirálne sulfoxidy patria do skupiny organických látok, ktoré sú schopné poskytovať diastereoizomérne interakcie, čo ich predurčuje na využitie v asymetrických syntézach, či už vo funkcii reagentov, ligandov alebo pomocných látok. Význam separácie takýchto látok rastie s použitím takýchto látok pri syntéze liečiv, farmaceutických prípravkov a iných látok s dopadom na zdravie človeka. Na chromatografickú separáciu vybranej skupiny chirálnych sulfoxidov sa použila teikoplanínová chirálna stacionárna fáza (CHIROBIOTIC TAG). Bolo použitých niekoľko mobilných fáz za účelom optimalizácie chromatografického systému. Na termodynamické štúdium boli následne vybrané okyslené metanolické mobilné fázy s rôznym prídavkom dietylamínu do zloženia mobilnej fázy z dôvodu preskúmania retenčného/enantioseparačného mecha­nizmu študovaných látok. Napriek zmenám v zložení mobilnej fázy neboli pozorované žiadne zmeny koelúcie, či zmeny v retenčnom alebo enantioseparačnom mechanizme v rámci študovaného rozsahu teplôt. Retencia analytov je entalpicky riadená a enantioseparácia je vo väčšine prípadov energeticky riadený proces. Ako významný faktor sa javí poloha a charakter funkčných skupín v blízkosti stereo­génneho centra. Pozitívny vplyv na retenciu a enantioseparáciu má prítomnosť polárnych interakcií v mobilnej fáze.

Kľúčové slová: sulfoxidy –  teikoplanin aglykón – enantiomérne separácie – HPLC


 

Chirálne stacionárne fázy na báze makrocyklického antibiotika zaujali predovšetkým vďaka schopnosti uskutočňovať enantioseparácie v normálnom, polárnom i polárno-organickom móde (1). Ukázali sa ako vhodné na separáciu chirálnych látok s rôznou polaritou (2 – 6). Ich efektivita sa osvedčila aj pri separácií aminokyselín (7 – 12), potravinových farbív (13) a pri kontrole farmaceutickej čistoty niektorých chirálnych látok (14, 15). Dávnejší výskum enantioseparácie niektorých látok ukázal zvýšenú efektivitu samotného aglykónu týchto glykopeptidových chirálnych stacionárnych fáz v porovnaní s ich analógmi, ktoré majú vo svojej štruktúre navyše prítomné sacharidové jednotky (2 – 4, 6, 16). Termodynamické štúdium separácie spolu s možnosťou použitia viacerých mobilných fáz pri separácií tých istých látok ponúkajú spôsob ako lepšie pochopiť enantioseparačný mechanizmus študovaných látok. Vzhľadom na to, že teplota predstavuje významný parameter, jej kontrolovanou, systematickou zmenou, možno sledovať vplyv na retenciu (rovnica 1) a enantioseparáciu študovaných látok (rovnica 2). Z van ´t Hoffových závislostí z rovnice 1     (1)

v prípade lineárnych závislostí logaritmu retenčného faktora (ln ki) od prevrátenej hodnoty termodynamickej teploty (1/T), možno zo smernice takejto závislosti, kde R je univerzálna plynová konštanta a T je termo­dynamická teplota, určiť ?Hi (transferovú entalpiu enantioméru) a z úseku takejto závislosti ?Si (transferovú entropiu enantioméru), pochopiteľne za predpokladu že poznáme hodnotu fázového pomeru (?).

Použitím van ´t Hoffových závislostí (ln ?  vs. 1/T) možno preskúmať akým spôsobom vplýva zmena teploty na enantioselektívny faktor (?) a na základe určenia hodnôt termodynamických parametrov ?(?H2,1) a ?(?S2,1) získaných z týchto závislostí (rov­nica 2) posudzovať aj ich jednotlivý vplyv na enantioseparáciu    (2)

Cieľom tohto príspevku je poukázať na rozdiely v prípade použitia rôznych mobilných fáz pri separácií vybranej skupiny chirálnych sulfoxidov a využiť termodynamické štúdium na posúdenie vplyvu zloženia mobilnej fázy na separáciu študovaných sulfoxidov v teikoplanínovej kolóne CHIROBIOTIC TAG, ako aj na hodnoty termodynamických parametrov.

Experimentálna časť

Chemikálie

Metanol (MeOH) pre gradientovú HPLC (Merck), acetonitril (ACN, Merck), hexán (Hex, Merck), etanol (EtOH, Merck), kyselina octová (Hac, Lachema Brno), dietylamín (Dea, Merck) a H2O pre chromatografiu (Merck). Na analýzu a na termodynamické štúdium sa použili vzorky štandardov chirálnych sulfoxidov (obr. 1), ktoré boli zosyntetizované ako racemáty na odde­lení chémie na štátnej univerzite v Iowe (Iowa State Univerzity, Gilman Hall, USA). Analyty boli rozpus­tené v metanole s koncentráciou 1 mg/ml.

Chromatografická analýza

Na HPLC analýzu asymetrických sulfoxidov sa použil kvapalinový chromatograf série HP 1100 pozostávajúci z vysokotlakového čerpadla, dáv­kovacieho ventilu Rheodine, termostatu kolóny (LCT 5100, INGOS, Česká Republika), detektora s diódovým poľom a s polarimetrickým detektorom Chiralyser (IBZ MESSTECHNIK, Nemecko) zapojeným v sérií. Ako chirálna stacionárna fáza sa použila kolóna (Chiro­biotic TAG) (250 x 4, 6 mm I. D.) (Astec, USA). Na termodynamické štúdium sa použilo niekoľko mobilných fáz (MF): MeOH na gradientovú analýzu (MF1), MeOH/Hac (100/0,1 v/v) (MF2), MeOH/Hac/Dea (100/0,1/0,025 v/v/v) (MF3), MeOH/Hac/Dea (100/0,1/0,05 v/v/v) (MF4), MeOH/Hac/Dea (100/0,1/0,1 v/v/v) (MF5), MeOH/Hac/Dea (100/0,1/0,15 v/v/v) (MF6). Ďalšie použité MF: MeOH/ACN (90/10 v/v) (MF7), MeOH/ACN (80/20 v/v) (MF8), MeOH/ACN (50/50 v/v) (MF9), MeOH/ACN (20/80 v/v) (MF10), MeOH/ACN (10/90 v/v) (MF11), ACN (MF12) MeOH/H2O (90/10 v/v) (MF13) a Hex/EtOH (90/10 v/v) (MF14). Rýchlosť prietoku MF bola 1 ml/min a dávkovaný objem bol 20 ?l. Termodynamické štúdie enantio­separácie sa uskutočnili v teplotnom rozsahu od 10 do 50 °C s inkrementom 10 °C. Presnosť kon­trolovanej teploty bola ± 0,1 °C. Na UV detekciu látok bola vybratá vlnová dĺžka pri 254 nm.

Výsledky a diskusia

Skupina chirálnych sulfoxidov vybratých na toto štúdium je zobrazená na obrázku 1. Charakter použitej chirálnej stacionárnej fázy umožňuje uskutočňovať merania vo viacerých módoch tak v polárno-orga­nickom, ktorý bol použitý na preskúmanie vplyvu teploty na retenciu a enantioseparáciu, ale aj v reverznom, či normálnom móde bez straty separačnej účinnosti. Pochopiteľné rozdiely však možno pozo­rovať v retencii študovaných analytov vzhľadom na polaritu MF, ako aj na kyslosť, resp. zásaditosť použitých MF. Na obrázku 2 je znázornený vplyv zloženia vybraných MF na hodnotu retenčných fakto­rov a na hodnoty enantioselektívnych faktorov. MF7 až MF12 predstavujú mobilné fázy s rôznym pomerom MeOH a ACN. S postupným zvyšovaním percenta acetonitrilu v MeOH, retencia poklesne až na určité minimum a následne postupným zvyšovaním v pros­pech percentuálneho zastúpenia ACN možno opäť sledovať nárast retencie, ale na úkor enantioselektivity, ktorá klesá s postupným zvyšovaním prídavku ACN do MF. Nahradením ACN vodou – MF13, sa časy analýz skrátia, ale v porovnaní s MF1 možno pozorovať opäť zhoršenie enantioselektivity. Zvýšiť enantio­selektivitu možno naopak použitím hexánu s 10% prídavkom etanolu (MF14). Na obrázku 3 možno vidieť akým spôsobom sa ovplyvní selektivita a retencia študovaných enantiomérov. V prípade MF14 je enantioseletivita porovnateľná s MF1, ale v prípade MF14 možno pozorovať extrémny nárast hodnôt retenčných faktorov. Navyše, kým v prípade MF1 sú ako najmenej zadržiavané analyty s halogénovým-substituentom v polohe 3 a najviac zadržiavané s halogenovým substituentom v polohe 4, v prípade MF14 možno pozorovať úplne iný trend. Ako je zrejmé z obrázku 3, poloha a charakter halogénového substituenta hrá významnú úlohu pri retencii študovaných sulfoxidov. Vzhľadom na čas analýz a enantioselektivitu je dôležitá prítomnosť polárnych interakcií medzi molekulami rozpúšťadla a enan­tiomérmi.

Na termodynamické štúdium separácie boli vybraté metanolové mobilné fázy MF1 a MF2 až MF6, s kon­štantým prídavkom Hac, ale rôznym prídavkom dietylamínu do zloženia MF. Priame zapojenie chirálneho detektora do série za UV detektor umožnilo kontinuálne sledovať a kontrolovať poradie elúcie racemických enantiomérnych zmesí. V teplotnom intervale od 10 – 50 °C neboli pozorované žiadne koelúcie ani zmeny v poradí elúcie, čo malo za násle­dok že S-(+) enantiomérna forma týchto študovaných sulfoxidov eluovala vždy ako prvá. Výsledky van´t Hoffovej lineárnej regresie (ln ki vs. 1/T) sú zhrnuté do tabuľky 1 a 2. Použitie štatistickej metódy ANOVA umožnilo posúdiť podobnosť v retenčných mechanizmoch študovaných látok pri použití rôznych MF, prípadne uvažovať o rozdieloch, ktoré sú štatistic­ky významné pri zvolenej hladine významnosti ? = 5 %. Rozdielny retenčný mechanizmus S-(+) a viac zadržiavaného R-(-) enantioméru sa odzrkadlil aj na hodnotách enantioselektívneho faktora, ktoré boli najvyššie pri teplote 10 °C. Na základe výsledkov regresných analýz van´t Hoffových analýz logaritmu retenčného faktora od recipročnej hodnoty termodynamickej teploty sa prídavok Dea do zloženia MF pre MF3, MF4, MF5 a MF6 javí ako nevýznamný.

Takúto podobnosť v retenčných mechanizmoch bolo možné pozorovať v prípade všetkých študovaných analytov, ako aj v prípade S-(+) enantioméru elujúceho ako prvého a aj v prípade R-(-) enantioméru.

Významné rozdiely však možno pozorovať pri porovnaní týchto výsledkov van´t Hoffových analýz so získanými výsledkami regresných analýz pri použití MF1 a MF2. Dokonca v prípade enantiomérov S-(+) analytov 1, 2, 10, 11 a R-(-) enantiomérov analytov 1 a 2 možno hovoriť aj o podobností v retenčnom mechanizme pri použití MF1 a MF2. V prípade ostat­ných analytov sa pozoroval rozdielny vplyv energetických i stérických interakcií, čo spôsobilo, že rozdiely v retenčnom mechanizme boli pri použití MF1 od MF2 štatisticky významné. Obrázky 4 a 5 poukazujú na skutočnosť akým spôsobom zmena zloženia MF ovplyvňuje retenciu študovaných enantiomérov. Je zrejmé, že okyslenie MF malo za následok zníženie hodnôt retenčných faktorov, až v prípade analytu 12 možno tento podobný trend dokumentovať v prípade všetkých študovaných analytov. Omnoho výraznejšie sa tento klesajúci trend hodnôt retenčných faktorov pozoroval s prídavkom Dea do MF.

Na obrázku 6 je znázornený vplyv zloženia mobil­ných fáz, ktoré boli použité na termodynamické štúdium, na hodnoty enantioselektívneho faktora, pre vybraté analyty. Takýto trend bol pozorovaný pri všetkých použitých teplotách. Pri použití MF1, meta­nolu bez prídavku Hac a Dea boli pre arylmetylsulfo­xidy (analyt 3 – 12), pozorované najvyššie hodnoty enantioselektívneho faktora. V prípade toluylmetyl­sulfoxidov (analyt 10 – 12), brómfenyl- metylsulfoxidov (analyt 7 – 9) a chlorofenylmetylsulfoxidov (analyt 4 – 6) sa ako významná z pohľadu enantioselektivity javí aj poloha substituenta viazaného na benzénovom jadre. Vo všeobecnosti však v súvislosti s enantioselektivitou možno hovoriť aj o type substituenta ako o významnom faktore, ktorý vplýva na hodnotu enantioselektívneho faktora. Spomedzi všetkých študovaných sulfoxidov analyzovaných za rovnakých podmienok, pri použití metanolových MF boli pre fluórfenylmetylsulfoxid (analyt 3) pri 20 °C dokumentované najvyššie hodnoty enantiosektívneho faktora pre MF1, ? = 1,68.

Na základe hodnôt termodynamických parametrov ?(?H2,1) a ?(?S2,1) získaných z lineárnej van´t Hoffovej závislosti ln ? vs. 1/T na kolóne CHIROBIOTIC TAG (tab. 3) možno usudzovať o podobnosti, či rozdielnosti v jednotlivých enantioseparačných mechanizmoch. Navyše možno posúdiť, či zmena kyslosti, resp. zásaditosti mobilnej fázy zohráva dôležitú úlohu, alebo je štatisticky nevýznamná na zvolenej hladine spo­ľahlivosti. V prípade analytu l, aj napriek rozdielnym príspevkom energetických a stérických interakcií v závislosti od zloženia MF, možno hovoriť o podob­nom enantioseparačnom mechanizme. V prípade analytu 2 je podobný len pri väčších prídavkoch Dea do zloženia MF. Zistilo sa, že teplota nevplýva významne na enantioselektivitu systému, preto by určenie termodynamických parametrov lineárnou regresiou bolo zaťažené príliš veľkou chybou. Napriek tomu možno usudzovať o sterických interakciách ako o významných pri enantioseparácii aj bez ich exaktného určenia van´t Hoffovou analýzou. V prípade analytov 3, 4, 6, 7, 8, 9 možno hovoriť o vzájom­nom vplyve energetických aj sterických príspevkov na enantioseparáciu, s dominantným vplyvom energetických interakcií. Hodnoty korelač­ných koeficientov ukazujú na linearitu týchto van´t Hoffových závislostí a na trend zmeny hodnoty enantioselektívneho faktora s teplotou. V prípade analytu 5 sa pozoroval signifikantne odlišný mechanizmus separácie pri použití MF2 ako štatisticky významný. Napriek tomu boli najvyššie hodnoty enantioselektívneho faktora zaznamenané pre MF1. Zvláštnu skupinu tvoria sulfoxidy s prítomným toluylom vo svojej štruktúre. Najväčší vplyv zloženia MF na enantioselektivitu možno demonštrovať na príklade analytu 11. Rozdielnosť v enantioseparačnom mechanizme sa prejavila pri každej použitej MF. Kým pri MF6 sa hodnota enantioselektívneho faktora s teplotou výrazne nemení, pri použití MF1 sa mení výraznejšie, aj keď najmenej spomedzi tých istých polohových izomérov. Dokonca v prípade použitia MF4 a MF5 je hodnota ?(?S2,1) kladná, čo poukazuje na skutočnosť, že zmena retencie s teplotou je výraznejšia v prípade enantioméru, ktorý eluuje ako prvý, čo robí tento enantioseparačný mechanizmus odlišný od iných. V prípade analytu 10 už zmena zloženia MF neznamenala výraznejšiu zmenu v enantioseparačnom mechanizme, pochopiteľne s výnimkou MF1, teda mobilnej fázy tvorenej čistým MeOH. To, že rôzne zloženie MF, môže mať za následok zmenu v enantioseparačnom mechanizme, možno ilustrovať na príklade analytu 12. Možno dokonca pozorovať tri rôzne separačné mechanizmy: patriace MF1 mobilnej fázy bez prídavku Hac a Dea, dalej MF2 a MF3 mobilným fázam s nulovým a najmenším prídavkom Dea do zloženia MF a posledný tretí možno rezervovať pre mobilné fázy s najväčšími prídavkami Dea do MF (MF4, MF5 a MF6).

Práca vznikla v rámci projektov: APVV 20-035205 a VEGA 1/2460/05.

Literatúra

1.     ARMSTRONG, D. W, TANG, Y., CHEN, S., ZHOU, Y., BAGWIL, C., CHEN, J. R.:  Macrocyclic antibiotics as a new class of chiral selectors for liquid chromatography. Anal Chem, 66, 1994, s. 1473 – 1484.
2.    LIU, Y., BERTHOD, A., MITCHELL, C. R., XIAO, T. L., ZHANG, B.,     ARMSTRONG, D. W.: Super/subcritical fluid chromatography chiral separations with macrocyclic glycopeptide stationary phases. J Chromatogr A, 978, 2002, s.185 – 204
3.    ABOUL-ENEIN, H. Y., ALI, I.: Chiral resolution of clenbuterol, cimaterol, and  mabuterol on Chirobiotic V, T, and TAG columns. J Separat Sci, 25, 2002, s. 851 – 855.
4.    BERTHOD, A., XIAO, T. L., LIU, Y., JENKS, W. S., ARMSTRONG, D. W.:     Separation of chiral sulfoxides by liquid chromatography using macrocyclic glycopeptide chiral stationary phases. J Chromatogr A, 955, 2002, s. 53 – 69.
5.    WARD, T. J., FARRIS III, A. B.: Chiral separations using the macrocyclic antibiotics:  A review. J Chromatogr A, 906, 2001, s. 73 – 89.
6.    BERTHOD, A., CHEN, X., KULLMAN, J. P., ARMSTRONG, D. W., GASPARRINI,     F., D’AQUARICA, I., VILLANI, C., CAROTTI, A.: Role of the carbohydrate moieties in chiral recognition on teicoplanin-based LC stationary phases. Anal Chem, 72, 2000, s. 1767 – 1780.
7.    ARMSTRONG, D. W., TANG, Y., CHEN, S., ZHOU, Y., BAGWILL, C., CHEN, J. R.: Macrocyclic antibiotics as a new class of chiral selectors for liquid chromatography. Anal Chem, 66, 1994, s. 1473 – 1484.
8.    PÉTER, A., TÖRÖK, G., ARMSTRONG, D. W.: High-performance liquid chromatographic separation of enantiomers of unusual amino acids on a teicoplanin chiral stationary phase. J Chromatogr A, 793, 1998, s. 283 – 296.
9.    BERTHOD, A., LIU, Y., BAGWILL, C., ARMSTRONG, D. W.: Facile liquid chromatographic enantioresolution of native amino acids and peptides using a teicoplanin chiral stationary phase. J Chromatogr A, 731, 1996, s. 123 – 137.
10.    PÉTER, A., TÖRÖK, G., ARMSTRONG, D. W., TÓTH, G., TOURWE, D.: High-performance liquid chromatographic separation of enantiomers of synthetic amino acids on a ristocetin A chiral stationary phase. J Chromatogr A, 904, 2000, s. 1 – 15.
11.    TÖRÖK, G., PÉTER, A., ARMSTRONG, D. W., TOURWE, D., TÓTH, G., SAPI, J.: Direct chiral separation of unnatural amino acids by high-performance liquid chromatography on a ristocetin A-bonded stationary phase. Chirality, 13, 2001, s. 648 – 656.
12.     PÉTER, A., ÁRKI, A., TOURWÉ, D., FORRÓ, E., FÜLÖP F., ARMSTRONG, D. W.: Comparison of the separation efficiencies of Chirobiotic T and TAG columns in the separation of unusual amino acids. J Chromatogr A, 1031, 2004, s. 159 – 170.
13.    EKBORG-OTT, K.-H., ARMSTRONG, D. W.: In: Chiral Separation: Application  and Technology, ACS, Washington, DC, 1997 (Chapter 9).
14.    EKBORG-OTT, K.-H., LIU, Y., ARMSTRONG, D. W.: Highly enantioselective HPLC separations using the covalently bonded macrocyclic antibiotic, ristocetin A, chiral stationary phase. Chirality, 10, 1998, s. 434 – 483.
15.    ARMSTRONG, D. W., HE, L., YU, T., LEE, J. T., LIU, Y.: Enantiomeric impurities in chiral catalysts, auxiliaries, synthons and resolving agents. Part 2. Tetrahedron: Asymmetry, 10, 1999, s. 37 – 60.
16.    D’AQUARICA, I., GASPARRINI, F., MISITI, D., ZAPPIA, G., CIMARELLI, C., PALMIERI, G., CAROTTI, A., CELLAMARE, S., VILLANI, C.: Application of a new chiral stationary phase containing the glycopeptide antibiotic A-40,926 in the direct chromatographic resolution of ?-amino acids. Tetrahedron: Asymmetry, 11, 2000, s. 2375 – 2385.



D. Meričko, J. Lehotay, J. Čižmárik
Ústav analytickej chémie, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU, Bratislava
Katedra farmaceutickej chémie, Farmaceutická fakulta UK, Bratislava

SUMMARY


D. Meričko, J. Lehotay, J. Čižmárik

THE INFLUENCE OF MOBILE PHASE COMPOSITION ON SEPARATION AND THERMODYNAMIC STUDY OF ENANTIOSEPARATION OF CHIRAL SULFOXIDES USING CHIROBIOTIC TAG CHIRAL STATIONARY PHASE


Chiral sulfoxides represent a group of organic compounds, which are able to introduce diastereoizomeric interactions. Due to this ability, they are using in asymmetric synthesis, both as reagents and ligands. The importance of sufficient separation increases in the case of using them for synthesis of pharmaceuticals, but also other final products with direct effect on the health of human beings. Teicoplanin chiral stationary phase (CHIROBIOTIC TAG) was used for chromatographic separation of selected sulfoxides. Methanol mobile phases with constant contribution of acetic acid, but with different addition of diethylamine were used for thermodynamic study in order to explore retention/enantioseparation mechanism of studied compounds. There were observed no coelutions, nor changing in elution order regardless the composition of the mobile phase. Moreover no changing in retention or enantioseparation mechanisms were observed within studied range of temperatures. The retention of the analytes is enthalpy driven and enantioseparation is mostly energetic driven process. The position and character of functional groups, which are close to the stereogenic centre, seems to have an important influence. In addition, the present of polar interactions in mobile phase has positive influence on retention and enantioseparation.
Key words: sulfoxides – teicoplanin aglycone – enantiomeric separation – HPLC


Partneri