8/2010

Časopis Farmaceutický obzor 8/2010.

Úvodník

Profesor MUDr. Pavel Švec, DrSc. jubiluje         203

Prehľady a experimentálne práce

T. Stankovičová, E. Kráľová, Z. Slováková, L. Vojteková, A. Ondrašinová, Ľ. Okruhlicová, N. Tribulová: Účinok rybieho oleja a atorvastatínu na krvný tlak a vybrané EKG parametre u hHTG potkanov         204
M. Snopková, H. Černecká, P. Křenek, J. Kyselovič, S. Jankyová, Z. Bajuszová, P. Mučaji, M. Nagy, J. Klimas: Štúdium účinku prírodných látok na experimentálnu endotelovú dysfunkciu         209
E. Račanská, I. Tumová, E. Pažin-Hricková: Komplexné zlúčeniny derivátov kyseliny aminoetyl- a karboxy­metylasparágovej a ich potenciálne protizápalové a hypoglykemické účinky         214
L. Mésarošová, J. Švihra, S. Fraňová, A. Hrabovská, P. Křenek, J. Kyselovič, P. Ochodnický: Úloha kaveolínu 1  v procese proliferácie svetlobunkového adenokarcinómu obličiek         219
M. Kuželová, L. Repická, E. Ondriašová, B. Kovácsová, J. Mazag, T. Foltánová: Je včasná liečba pacientov so zriedkavými ochoreniami v Slovenskej republike reálne dostupná?         223
P. Křenek, A. Gažová, D. Kučerová, I. Kanková, M. Horváthová, J. Klimas, P. Ochodnický, J. Kyselovič: Účinok krátkodobého podávania enalaprilu na masu ľavej komory a expresiu endotelovej NO syntázy u normotenzného potkana        228
J. Mysliveček, A. Hrabovská: Hypothalamus – hlavní integrační centrum somato-autonomních funkcí         235

  • J. Mysliveček, A. Hrabovská
  • Hypothalamus – hlavní integrační centrum somato-autonomních funkcí
  • Farm Obz, 79, 2010, 8, s. 235-240

Kromě somatického a humorálního systému jsou funkce v organismu řízeny i autonomním nervovým systémem. V tomto článku jsou přehledně ukázány mechanismy integrační funkce hypothalamu, které se na regulačních pochodech podílejí.

Klíčová slova: hypothalamus – neuroendokrinní kontrola – autonomní nervový systém.


Má-li být jakákoliv funkce v organismu efektivní, musí být regulována. Tak se děje na intracelulární úrovni, ale i na úrovni vyšších celků, včetně celého organismu. Jsou to především somatický nervový systém a humorální systém, kdo řídí děje v organismu. Mimo ně (ale i zároveň s nimi) do regulačních pochodů zasahuje i další nervový systém – autonomní (či vegetativní) nervový systém (ANS) (1). Pojem auto­nomní nervstvo vyjadřuje porovnání ovladatelnosti se somato-moto­rickým systémem. Pojem vegetativní ukazuje na ty orgánové systémy, které zajišťují životní funkce bez závislosti na naší vůli; mající vztah k útrobám.

Řízení vegetativních funkcí je zajišťováno jednak z autonomních ústředí centrálního nervového systému, jednak jde o reflexní činnost periferních oddílů autonomního nervového systému.

Autonomní ústředí

Ústředí autonomního nervového sys­té­mu jsou integrátory reakcí organizmu na vnější a vnitřní skutečnosti se vztahem k řízení autonomních funkcí. Hypothalamus lze považovat za hlavní integrační centrum somato-autonomních funkcí. Hypothalamus je poměrně komplikovaná struktura, která je tvořena více než 20 jádry. Funkce jednotlivých hypothalamic­kých oblastí a jader je uvedena v tab. 1. Hypothala­mické spoje lze rozdělit na aferentní (descendetní a ascendentní) a eferentní. Oboje jsou zjednodušeně zobrazeny na obrázku 1. Eferentní vlákna směřující do talamu a limbického systému jsou dále propojena s kůrou.

Integrační funkce hypothalamu

Funkci hypothalamu je možné charakterizovat jako integrační, s tím, že funkce jím integrované jsou početné. Základní schéma funkce hypothalamu s ohle­dem na jeho integrační funkce, které ukazuje propojení na jednotlivé funkční systémy je na obrázku 2.

Řízení příjmu potravy a tekutin

Zrakové podněty potravy a jejího příjmu interagují s osou trávicí trakt (GIT)-mozek na úrovni hypo­thalamu (2). Hypothalamická odpověď na příjem glukózy je významně změněna u pacientů diabetes mellitus II. typu (DM2), což ukazuje na zapojení hypothalamu do tohoto onemocnění. Peptidy trávicího traktu regulují pocit sytosti. Tyto peptidy jsou zapojeny i do sekrece insulinu a citlivosti na insulin. Peptid YY (PYY) je hormon GIT který také reguluje kostní metabolismus. Existuje řada nálezů, které popisují význam aferentních GIT nervů, zejména vagu, v mo­dulaci funkce osy GIT-mozek. U zdravých jedinců vede ingesce glukózy k poklesu neuronální aktivity hypothalamu. Tento inhibiční efekt však chybí u pa­cientů s DM2. Dá se tedy předpokládat, že hypothalamické neurony pacientů s DM2 chybně získávají či zpracovávají endokrinní signály z GIT. PYY je postprandiálně uvolňován a transportován krevní cestou do mozku (prochází hematoencefalickou bariérou) do ncl. arcuatus, kde se váže na Y2 receptory (presynaptické inhibiční receptory). Také se může vázat na Y2 receptory spojené s aferentními vlákny vagu, které projikují do ncl. arcuatus. V ncl.arcuatus existují dva systémy, které regulují příjem potravy: systém Strp/NPY („Short Tandem Repeat Polymorphism“/neuropeptid Y), který stimuluje příjem potravy a sys­tém POMC/alfaMSH (pro-opiomelanokortinový/alfa melanocyty stimulující hormon), který inhibuje příjem potravy. Informace z GIT se ovšem nepřenáší jen endokrinní cestou, ale je vedena i vagem (přes ncl. tractus solitarii, ncl. arcuatus). Stimulace vagu snižuje příjem potravy, žaludeční vyprazdňování a stimulaci pankreatické sekrece.

Molekulární integrace na úrovni hypothalamu zahrnuje celou řadu cest (cAMP/PKA; AMPK, PKC a další). Celý příjem je významně modulován cirkadiánními rytmy (poruší se při poruše hodinových genů). Odměna, plynoucí z jídla, je zpracovávána komplexními mechanismy (3), které zahrnují ncl. accumbens, ventrální pallidum ve ventrálním stratu, ventrální tegmentální oblast ve střením mozku a pro­jikující do mezolimbického dopaminového systému a zpět do ncl. accumbens, prefrontálního kortexu, hipokampu a amygdaly. Ovlivnění těchto struktur leptinem a ghrelinem je samozřejmě taky možné.

Obesita (ale i DM2) jsou charakterizovány zvýšeným bazálním tonem sympatiku (4) a zhoršenou sympatic­kou odpovědí na různé podněty jako je např. inzulín. U inzulin-resistentních jedinců před vývojem DM2 či obezity bylo ukázáno, že inzulínová rezistence je spojena se zvýšenou aktivitou sympatiku. Uvažuje se proto o tom, že hyperinzulinémie je iniciující faktor, který zvyšuje aktivitu sympatiku. Během doby se vy­víjí down-regulace a/nebo snížená citlivost adre­nergních receptorů (AR) vedoucí ke snížené odpovědi sympatiku. Postprandiálně to vede ke zhoršené potravou indukované termogenezi a zhoršené post­prandiální oxidaci tuků, což vede k akumulaci tělesné­ho tuku. Stresem aktivovaná hyperaktivita sympatiku pak reguluje neuropeptid Y (který má orexigenní účinky) a Y2 receptor pro neuropeptid Y ve viscerální tukové tkáni, což je zásobárna tuku nejúžeji spojená s DM2. Zvýšená aktivita sympatiku tak specificky přispívá ke vzniku abdominální obezity.

Sympatický nervový systém (SNS) hraje hlavní úlohu v regulaci metabolické a kardiovaskulární homeostázy (5). Nízká aktivita SNS se předpokládá jako rizikový faktor pro nárůst váhy a vznik obezity. Naproti tomu aktivace SNS je charakteristická řadou metabolických a kardiovaskulárních onemocnění, které se mnohem častěji vyskytují u obézních jedinců. V poslední době se zjistilo, že existují specifické změny v chování SNS u obezity. Aktivace kosterních svalů SNS se vztahuje k nárůstu viscerálního tuku. Viscerální obezita je prav­dě­podobně působena dysregulací osy hypothalamus-hypofýza-nadledvniny (HPA osa, z anglického „hypo­thalamic-pituitary-adrenal“) a paralelní aktivací SNS.

Řízení vegetativního nervstva

Periferní vegetativní nervstvo (PVN) je jedno z nej­důležitějších center kontroly ANS s neurony hrající hlavní roli v kontrole stresu, metabolismu, růstu, reprodukce, imunity a dalších tradičních autonomních funkcí (GIT, kardiovaskulární, renální). PVN je obvykle chápáno jako jádro, které zpracovává aferentní pod­něty z jiných oblastí do specifických výstupů: neuroendokrinních a autonomních. PVN ale hraje i úlohy v integračních dějí mnoha zdrojů aferentních signálů při vytváření integrované autonomní odpovědi mnoha drah (6). Dysregulace těchto pochodů může vést k hypertensi a městnavému srdečnímu selhání. Individuální aferentní vstupy (subfornikální orgán, mediální septum, střední preoptické jádro, ncl. arcuatus, ncl. suprachiasmaticus - SCN), signální molekuly (orexiny, adiponektiny) a interneurony (glutamatergní, GABAergní) mají potenciál ovlivnit (koordinovat) mnohotné výstupy z PVN. Ve zprostředkování této integrační úlohy se uplatňuje angiotensin II jako hlavní mediátor v PVN, výstupy jsou neuroendokrinní (kortikoliberin, tyreoliberin, oxytocin, vazopresin) a autonomní (PVN vysílá eferentní vlákna do mozkového kmene (ncl. tractus solitarii), míchy (intermediolaterální kolumna)).

Řízení sekrece hormonů

V ncl. supraopticus po podráždění osmoreceptorů dojde ke zvýšené sekreci vazopresinu/antidiuretického hormonu. V ncl. paraventricularis se tvoří oxytocin. Oba tyto hormony jsou transportovány axonálním trans­portem do neurohypofýzy, odkud jsou teprve secer­novány do portálního obě­­hu. Přímo z hypothalamu jsou do oběhu (portálního systému hypofyzárního) secernovány liberiny/inhibiny: tyreoliberin, gonado­tropiny uvolňující hormon, soma­toliberin, somatosta­tin, liberin melanotropinu, inhibitor melanotropinu, inhibitor prolaktinu a liberin luteotropního hormonu. Hormony mohou mít nejenom své obvyklé funkce, ale je třeba je chápat i jako součást dějů, v nichž se funkce v hypothalamu integrují.

Existuje dvojsměrná síť interakcí mezi CNS, endo­krinním systémem a imunitním systémem. Existence těchto drah umožňuje například při zkušenosti se stresem ovlivňovat imunitní systém s důležitými důsledky pro zdraví (7). I vylučované hormony mohou ovlivňovat autonomní funkce. Tak například estrogeny mohou ovlivňovat baroreflex, GABA a glutamátergní transmisi v různých autonomních jádrech, mohou ovlivňovat i zvýšený sympatický tonus (8).

Řízení sexuálních funkcí

Jsou zajišťovány integrační činností hypothalamu jako křižovatky propojující CNS s humorální sekrecí. To je zajišťováno zadním hypotalamem a tuberální partií ve střední části, která se považuje za zodpověd­nou za vznik ženského sexuálního chování, zatímco chování mužské je ovlivňováno preoptickou oblastí.

Řada nálezů svědčí pro to, že oxytocin a vazopresin modulují komplexní sociální chování a sociální kognici (9). Tyto vývojově staré peptidy jsou významně konzervovány z hlediska geneticky struktury a expre­se, avšak jsou rozrůzněné ve způsobu genetické regulace receptorů, takže se předpokládá, že podléhají přirozené variaci v sociálním chování jak mezi tak uvnitř druhů. Humánní studie zatím naznačují, že variace v genech kódujících receptory pro tyto mole­kuly může přispět k variacím v lidském sociálním chování změnou funkce mozku. Vliv oxytocinu na chování je představován především vývojem mateřské­ho chování u potkaních samic (virgo) a u člověka pečovacím chováním, párovou vazbou (selektivní preference určitého typu partnera). Vazopresin ovlivňuje jednak monogamní chování (otcovská péče, hlídání partnera) u hrabošů prérijních, jednak vokali­zaci a teritoriálně-agresivní chování u ptáků. Individuální rozdíly závisí na kvantitativní expresi receptorových podtypů V1a a V1b. Oxytocin má pouze jeden receptorový typ (OT). A právě variace v genech pro vazopresinové receptory V1a (AVPR1A) hrají úlo­hu ve variabilitě sociální chování u lidí. Například při přítomnosti delší mikrosatelitní alely v tomto genu se zvyšuje altruismus jedince. Obdobně i přítomnost alelové varianty (RS3 334) vede ke zvýšení problému ve vytváření párové vazby (9).

Účast na emočních stavech

ANS integruje aferentní a motorickou aktivitu pro homeostatické procesy včetně bolesti (10). Neurotické osoby jeví zvýšený kardiální vagový tonus v souvis­losti s bolestivými podněty, zatímco emočně stabilnější jedinci mají snížený či negativní kardiální vagový tonus. ANS představuje substrát pro spojení mezi osobností a odpověďmi na bolest a je v tomto smyslu integračním prostředkem. Dále existuje sympatická a parasympatická koaktivace evokovaná bolestí spo­jená dále s vasodepresí, která je podobná u somatické i viscerální bolesti.

Stres je rizikovým faktorem vývoje adikce (11). Čas­ný stres a podvýživa vedou ke změnám v hladinách kortikoliberínu, HPA ose, extrahypotalamického kortiko­liberínu, aktivace ANS a centrálního noradrenergního systému. Účinky těchto změn na kortikostriatální-limbický motivační, adaptační systém a paměť zahrnují mesolimbické dopaminové, glutamátové a GABA cesty. Stress také zvyšuje riziko poruch nálady a anxietu, které jsou často doprovázeny adikcí, je proto důležité zjistit, zda existují specifické stresové faktory, které přispívají ke vzniku poruch nálady a zvyšují náchyl­nost k adikci.

Během aktivních období denního rytmu člověka je potřeba zajišťovat kardiorespirační regulaci (12). Pro toto studium je možné použít následujících metod:

1. stresem indukovanou obranu (útěk či útok), protože stresory působí jak kognitivní, emoční, tak behaviorál­ní změny a autonomní změny, 2. rozdíly spánek/bdění. Bazální respirace a regulace respiračních reflexů se liší ve spánku a bdění. Orexinový systém (orexin A, orexin B), který je nezbytný pro regulaci chování vedoucí k příjmu potravy, energetickou homeostázu a motivaci funguje také jako nezbytný modulátor pro koordinační okruhy kontrolující autonomní funkce a chování. Orexin ovlivňuje cestou medulární lokomoční oblasti chování, přes akveduktální šeď analgézii, přes raphe tělesnou teplotu, přes rostrální ventor­laterální míchu kardiovaskulární reflexy, přes ventrální rohy míšní respiraci a prostřednictvím PVN produkci hormonů, přes locus coeruleus, tubero­mamilární jádro a ncl. raphe dorsalis pak probouzecí kortikální reakce.

Řízení cirkadiánních rytmů

Řízení cirkadiánních rytmů je dáno rytmickou aktivitou vytvářenou v ncl. suprachiasmaticus. Biologic­ké rytmy ovlivňují všechny ostatní hypotalamické regulační funkce. Jako příklad lze použít rozdíly v bazální respiraci a regulace respiračních reflexů, která se liší ve spánku a bdění, porušení cirkadiánních rytmů může vést k imunitní dysregulaci atd.


Regulace imunitních pochodů

SCN jako generátor předává informace do periferie prostřednictvím ANS. Porušení cirkadiánních rytmů vede k imunitní dysregulaci a poslední nálezy svědčí pro to, že některé geny biologických hodin („clock genes“) společně s úlohou časové kontroly ovlivňují i imunitní funkce (13). Jedněmi z buněk, které jsou pod vlivem cirkadiánního rytmu, jsou NK buňky. Imunomodulační funkce zahrnují: 1) zvýšení aktivity Th1 cytokinů vlivem zvýšených (časných nočních) hladin prolaktinu (PRL) a růstového hormonu (GH), 2) imunomodulační funkci melatoninu a další. V součas­nosti se za čtyři základní hodinové geny považují Per1, Per2, Cry1, Cry2. Tyto geny působí na cílové genové struktury na vazebné místo CLOCK/BMAL1 v pro­moterové oblasti. Případně se cirkadiánně může měnit exprese transkripčního faktoru „D-site binding pro­tein“. Přibližně 10% mRNA podléhá cirkadiánní rytmicitě. Z SCN vedou přímé dráhy do PVN (sekrece kortikoliberínu). PVN ovšem také projikuje do páteřní míchy (do intermediolaterlárních sloupců, kde jsou lokalizovány autonomní pregangliová sympatická vlák­na). Nejsou charakterizovány schopností spontánně působit lýzu syngenních a zoogenních nádorových buněk, ale jsou v současnosti chápany jako buňky s kritickým významem pro iniciaci imunitní odpovědi. Jsou schopny detekovat a zabíjet aberantní buňky a rychle produkovat solubilní faktory jako chemokiny a cytokiny. NK uvolňují cytolytická granula (granzyme B) v cílových buňkách cestou TNF a FAS (CD95). Na regulaci mRNA v NK buňkách se podílí Per2 gen. Tvorba granzymu B je inhibována Bmal 1.

Ovlivnění chování

Autonomní nervový systém se účastní i integračních pochodů, které ovlivňují chování. Sem by patřily jed­nak změny chování spojené se stresem indukovanou náchylností k addikci (11), jednak bychom sem mohli počítat i význam vagové stimulace v ovlivnění depresí (14). Vagová stimulace (VNS) se ukázala jako vhodný nástroj k léčbě farmakoresistentní deprese (došlo ke zlepšení nálady). VNS je dobře tolerován u epileptiků (v léčbě farmakoresistentní epilepsie). VNS působí přes ncl. tractus solitarii se sekundárními projekcemi do limbických a kortikálních struktur, které se zapojují do regulace nálady, včetně oblastní mozkového kmene obsahujících serotoninergní (ncl. raphe) a noradrenergní (locus coeruleus) jádra které projikují do koncového mozku. Aferentní vagová vlákna totiž nesou senzoric­kou informaci z hlavy, krku, břicha, hrudníku do zadního medulárního komplexu, především do ncl. tractus solitarii (NTS). Přibližně 80 % vagových vláken jsou vlákna aferentní. Mimoto, bolestivá viscerální informace je též vedena do parabrachilálního jádra (PBN) a parakvekduktální šedi (PAG). Možnými mechanismy je desynchronizace neuronální aktivity, celková redukce kortikální excitability (to se vztahuje k antikonvulzivní terapii). U deprese jde možná o stimulaci struktur mozkového kmene a nepřímo o regulaci aktivity neuronů v limbických a kortikálních oblastech zodpovědných za náladu. Může jít o zvýše­nou či sníženou metabolickou aktivitu v amgydale, parahipokampálním gyru, insule a gyrus cinguli. V CSF se zvyšuje obsah homovanilové kyseliny.

Závěry

V tomto krátkém přehledu jsme ukázali, že řízení vegetativních funkcí hypotalamem je poměrně kom­plikovanou záležitostí, třebaže principy definované v minulém století zůstávají stále platné. Postupně se ale ukazuje, že přenos signálu podléhá velmi komplikovaným regulačním pochodům a že snaha po udržení homeostázy bývá dosahována pomocí něko­lika mechanismů, které se vzájemně doplňují a vytvá­řejí tak prostředí pro ideální řízení vegetativních funkcí.

Poděkování
Tato práce byla podpořena Rozvojovým projektem MŠMT 11/1, Česko-Slovenským Grantem MEB0810127/ APVV grant SK-CZ-0028-09 a grantem APVV SK-FR-0031-09.

Literatura

1.    BURNSTOCK, G.: Autonomic Neurotransmission: 60 Years Since Sir Henry Dale. Annu Rev Pharmacol, 49, 2009, č. 1, s. 1-30.
2.    ROMIJN, J.A., et al.: Gut-brain axis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 11, 2008, č. 4, s. 518-521.
3.    LENARD, N.R., BERTHOUD, H.-R.: Central and Peripheral Regulation of Food Intake and Physical Activity: Pathways and Genes. Obesity, 16, 2008, č. Supplement 3s, s. S11-S22.
4.    GREENFIELD, J.R., CAMPBELL, L.V.: Role of the Autonomic Nervous System and Neuropeptides in the Development of Obesity in Humans: Targets for The­rapy? Curr Pharm Design, 14, 2008, č. 18, s. 1815-1820.
5.    DAVY, K.P., ORR, J.S.: Sympathetic nervous system behavior in human obesity. Neurosci Biobehav Rev, 33, 2009, č. 2, s. 116-124.
6.    FERGUSON, A.V., LATCHFORD, K.J., SAMSON, W.K.: The paraventricular nucleus of the hypothalamus – a potential target for integrative treatment of autonomic dysfunction. Expert Opin Ther Targets, 12, 2008, č. 6, s. 717-727.
7.    KEMENY, M.E.: Psychobiological responses to social threat: Evolution of a psychological model in psychoneuroimmunology. Brain Behav Immun, 23, 2009, č. 1, s. 1-9.
8.    SALEH, T.M., CONNELL, B.J.: Role of oestrogen in the central regulation of autonomic function. Clin Exp Pharmacol Physiol, 34, 2007, č. 9, s. 827-832.
9.    DONALDSON, Z.R., YOUNG, L.J.: Oxytocin, Vaso­pressin, and the Neurogenetics of Sociality. Science, 322, 2008, č. 5903, s. 900-904.
10.    PAINE, P., et al.: Exploring relationships for visceral and somatic pain with autonomic control and personality. Pain, 144, 2009, č. 3, s. 236-244.
11.    SINHA, R.: Chronic stress, drug use, and vulnerability to addiction. Ann N Y Acad Sci, 1141, 2008, s. 105-130.
12.    KUWAKI, T., et al.: Emotional and state-dependent modification of cardiorespiratory function: Role of orexinergic neurons. Auton Neurosci-Basic Clin, 142, 2008, č. 1-2, s. 11-16.
13.    ARJONA, A., SARKAR, D.K.: Are circadian rhythms the code of hypothalamic-immune communication? Insights from natural killer cells. Neurochem Res, 33, 2008, č. 4, s. 708-718.
14.    NEMEROFF, C.B., et al.: VNS Therapy in Treatment-Resistant Depression: Clinical Evidence and Putative Neurobiological Mechanisms. Neuropsychopharmacology, 31, 2006, č. 7, s. 1345-1355.

 

J. Mysliveček, A. Hrabovská
Ústav zdravotnických studií, Technická univerzita Liberec, Česká republika
Fyziologický ústav 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze, Česká republika
Farmaceutická fakulta Univerzity Komenského v Bratislave, Slovenská republika

Summary

J. Mysliveček, A. Hrabovská

Hypothalamus – main integration center of somato-autonomic functions

The functions of an organism are regulated, beside somatomotoric and humoral systems, via autonomous nervous system. Here we review the hypothalamic integration functions which participate in the regu­latory mechanisms.
Key words: hypothalamus, neuroendocrine control, autonomous nervous system.

  • M. Kuželová, L. Repická, E. Ondriašová, B. Kovácsová, J. Mazag, T. Foltánová
  • Je včasná liečba pacientov so zriedkavými ochoreniami v Slovenskej republike reálne dostupná?
  • Farm Obz, 79, 2010, 8, s. 223-227

Výskum a vývoj liekov na liečbu zriedkavo sa vyskytujúcich ochorení sa stali prioritou zdravotníckych a výskumných programov viacerých členských štátov Európskej únie (EÚ). Práca pojednáva o reálnej dostupnosti liekov na zriedkavé ochorenia v Slovenskej republike (SR). Cieľom bolo zistiť, ktoré z liekov registrovaných v EÚ na zriedkavé ochorenia boli kategorizované a teda reálne dostupné v SR. Následne sme získané údaje analyzovali z hľadiska indikácií, ATC klasifikácie a rýchlosti kategorizačného procesu. V EÚ bolo k 1. 1. 2010 registrovaných 59 liekov na liečbu zriedkavých ochorení. Najviac liekov na zriedkavé ochorenia bolo registrovaných v ATC skupinách L - antineoplastiká a imunomodulátory – 27 (45,7 %) a A - tráviaci trakt a metabolizmus – 12 (20,3 %). V Slovenskej republike bolo k uvedenému dátumu kategorizovaných 24 liekov na zriedkavé ochorenia, čo predstavuje 40,7 % všetkých registrova­ných liekov v EÚ na zriedkavé ochorenia, ktoré sú určené predovšetkým pre onkologických pacientov – 9 (37,5 %) liekov a pacientom so zriedkavými tráviacimi a metabolickými ochoreniami – 6 (25 %) liekov. Všetky kategorizované lieky mali 100% úhradu zdravotnou poisťovňou. Do 12 mesiacov od registrácie bolo v SR kategorizovaných 8 liekov na zriedkavé ochorenia. Ostávajúcich 16 liekov na zriedkavé ochorenia zaostávalo o 1 – 38 mesiacov. Výsledky práce poukazujú na pozitíva liekovej politiky v SR z hľadiska úhrady liekov na liečbu zriedkavých ochorení, na druhej strane na problémy s včasnou dostupnosťou týchto liekov v SR.

Kľúčové slová: zriedkavé ochorenia – lieky na liečbu zriedkavých ochorení – registrácia liekov – kategorizácia liekov


Úvod

Zavedenie legislatívy o liekoch určených pre pacientov so zriedkavými ochoreniami do praxe v EÚ v roku 2000 predstavuje veľkú nádej pre približne 30 miliónov Európanov (1) a samozrejme aj pre všetkých obyvateľov Slovenskej republiky, ktorí trpia ochoreniami s prevalenciou nižšou ako 5 chorých na 10 000 obyvateľov. Európska legislatíva je zhrnutá v nariadení (ES) č. 141/2000 (2,3) a nariadení komisie (ES) č. 847/2000 (4) a priamo platí v každom členskom štáte EÚ. Najdôležitejšou podstatou tejto legislatívy je podpora a stimulácia vývoja liekov pre pacientov so zriedkavo sa vyskytujúcimi ochoreniami, ktorý by sa ináč najmä z finančných dôvodov neuskutočnil (5). Možnosť získať po registrácii dlhodobé výlučné postavenie na trhu (market exkluzivita) na obdobie 10 rokov je najvýznamnejším stimulom pre výrobcov liekov. Ďalšími dôležitými stimulmi pri vývoji liekov na zriedkavé ochorenia sú možnosť požiadať o kva­lifikovanú bezplatnú asistenciu v EMA (Európska lieková agentúra) ako aj zníženie poplatkov za registračný proces (6,7).

Európska legislatíva zaoberajúca sa liekmi na liečbu zriedkavých ochorení, by nebola účinná, ak by sa tieto lieky nedostali k pacientom (8). Skutočná dostupnosť pacientov so zriedkavo sa vyskytujúcimi ochoreniami k uvedeným liekom závisí do značnej miery od jednotlivých členských štátov. Úroveň liečby tejto skupiny ochorení v každej z vyspelých európskych krajín závisí od priorít v liekovej politike, tvorby cien liekov a výšky úhrady za lieky (9). Lieková politika by mala byť orientovaná tak, aby zabezpečila aj občanom so zriedkavo sa vyskytujúcimi chorobami dostupnosť kvalitných, účinných a bezpečných liekov (10, 11). Prieskum EURORDIS (najväčšia organizácia pacientov so zriedkavými ochoreniami v Európe), ktorý sa týkal reálnej dostupnosti zaregistrovaných liekov na zried­kavé ochorenia, odhalil značné rozdiely v dostupnosti liekov na zriedkavé ochorenia medzi jednotlivými členskými štátmi EÚ. Taktiež ukázal, že ceny jednotlivých liekov na zriedkavé ochorenia sa medzi susediacimi členskými štátmi Európskej únie líšia mnohokrát až trojnásobne. V niektorých členských štátoch EÚ sa pacienti neliečia liekmi tejto skupiny aj preto, že tieto nie sú dostatočne hradené (12). V Slo­venskej republike sa doteraz neuskutočnil prieskum ohľadne reálnej dostupnosti liekov na zriedkavé ochorenia, ktorý bol cieľom tejto práce.

Metóda

Zoznam liekov na liečbu zriedkavých ochorení registrovaných v EÚ s dátumami registrácie sme získali z internetovej stránky Európskej liekovej agentúry (EMA) (7). Sunitinib (SUTENT) nebol zahrnutý do našej analýzy, pretože bol na žiadosť držiteľa rozhodnutia o registrácii vyradený z registra liekov na zriedkavé ochorenia.

Údaje o kategorizácii týchto liekov v SR sme získali z kategorizačných zoznamov, vydávaných štvrťročne Ministerstvom zdravotníctva Slovenskej republiky, ktoré sú dostupné aj na internete (http://www.health.gov.sk/). Zaznamenávali sme názvy liekov a liečiv, ATC kódy a presné dátumy kategorizácie v SR, ktoré vyjadrujú dostupnosť liekov na zriedkavé ochorenia pre pacientov. Spracovali sme údaje z obdobia od mája 2004, kedy SR vstúpila do EÚ, do 1. januára 2010. U jednotlivých liekov na zriedkavé ochorenia sme zaznamenávali všetky liekové formy a sily, avšak lieky sme započítali do spracovávaných údajov len raz.

Ďalšími vyhľadávanými údajmi boli terapeutické indikácie, ktoré sme získali z internetového portálu pre zriedkavé ochorenia ORPHANET (13). Údaje boli vyhodnocované na základe:

1.    zaradenia (lieky na zriedkavé ochorenia boli rozdele­né do dvoch skupín: registrované a kategorizo­vané),
2.    ATC kódu (lieky na zriedkavé ochorenia boli rozde­lené do jednotlivých ATC skupín),
3.    dátumu registrácie a kategorizácie – údaje sme analyzovali z hľadiska:
a)    rokov, v ktorých boli jednotlivé lieky na zriedkavé ochorenia registrované a kategorizované,
b)    obdobia (mesiace), ktoré uplynulo od registrácie liekov na zriedkavé ochorenia v EÚ po ich kategorizáciu v SR.

Z dátumu registrácie a kategorizácie liekov na zriedkavé ochorenia v SR sme vypočítali zaostávanie kategorizácie za registráciou v mesiacoch. Za včasnú kategorizáciu liekov určených na liečbu zriedkavých ochorení sme považovali kategorizovanie do 12 me­siacov.

Výsledky a diskusia

Po vstupe Slovenskej republiky do Európskej únie v roku 2004, nadobudlo platnosť nariadenie (ES) 141/2000 o liekoch na ojedinelé ochorenia (2,7), z kto­rého vyplýva, že registrácia všetkých liekov na liečbu zriedkavých ochorení je automaticky platná v SR. Zavedenie lieku na trh si však riadi každý členský štát osobitne. V SR je liek dostupný na trhu až po kategorizácii t.j. udelení stupňa úhrady zdravotnou poisťovňou (1, 9).

K 1. 1. 2010 bolo v EÚ celkovo zaregistrovaných 59 liekov na zriedkavé ochorenia pre 45 indikácií; 45,8 % všetkých registrovaných liekov na zriedkavé ochorenia je určených na liečbu zriedkavo sa vyskytujúcich onkologických ochorení, 20,3 % na liečbu zriedkavých ochorení postihujúcich tráviaci trakt a metabolizmus, 11,8 % na liečbu ojedinelých ochorení centrálnej nervovej sústavy, 8,5 % liekov na liečbu kardio­vaskulárnych chorôb. Na liečbu ochorení postihujúcich krv a krvotvorné orgány, hormonálnych porúch a rôznych iných nezaradených ochorení je registro­vaných pre každú skupinu 3,4 % všetkých liekov na zriedkavé ochorenia a 1,7 % liekov je určených na liečbu ochorení urogenitálneho traktu, porúch týkajúcich sa pohlavných hormónov a zriedkavých infekčných chorôb. Celkový počet registrovaných liekov na zriedkavé ochorenia je porovnateľný s poč­tom liekov v USA, kde po siedmich rokoch bolo registrovaných 42 liekov na zriedkavé ochorenia. To dokazuje rovnaké tempo a úspešnosť legislatívy v Európe v porovnaní s USA (1, 5, 9).

Ako zdôrazňujú niektoré práce, pri kategorizácii liekov na liečbu zriedkavých ochorení nie je možné vždy vychádzať z ekonomických kritérií. Je potrebné prihliadať aj na starostlivé posúdenie očakávaného dlhodobého klinického prospechu. Aj napriek prijatej európskej legislatíve, reálny prístup pacientov so zriedkavými ochoreniami je v jednotlivých členských štátoch únie rozdielny (2, 3).

K 1. 1. 2010 bolo v Slovenskej republike kategori­zovaných 24 liekov na zriedkavé ochorenia, čo pred­stavuje 40,7 % z registrovaných liekov na zriedkavé ochorenia. Všetky, s výnimkou rufinamidu (Ino­velon), sú plne hradené zdravotnou poisťovňou. Doplatok pacienta pre INOVELON, je skôr symbolický (0,67 – 0,89 €) a závisí od sily a veľkosti balenia. Na jednej strane sú lieky na zriedkavé ochorenia v SR 100% hradené, na druhej strane ani polovica registrovaných liekov na zriedkavé ochorenia nie je pre pacientov so zriedkavými ochoreniami v SR okamžite a priamo dostupná. Tento fakt môže poukazovať na neatraktívne a nie úplne vyhovujúce podmienky v slovenskom zdravotníctve, ale aj na nezáujem farma­ceutických firiem o možnosť požiadať o kategorizáciu zaregistrovaných liekov pre liečbu zriedkavých ochorení v SR. Nedostatočná dostupnosť liekov na zriedkavé ochorenia nie je len slovenským fenoménom a problémom, podobné výsledky priniesli aj priesku­my, ktorý uskutočnil EURORDIS. V týchto priesku­moch sa sledovala včasná dostupnosť liekov na zriedkavé ochorenia, podobne ako v našej práci, po jednom roku od registrácie v EÚ (12).

V našej práci sme zaznamenali pozitívny rastúci trend počtu kategorizovaných liekov na liečbu zriedkavých ochorení (graf 1). Ani v roku 2010 však počet kategorizovaných liekov v SR nedosiahol 50 %. Následne sme zistili, že k 1. 1. 2010 je 37,5 % katego­rizovaných liekov na zriedkavé ochorenia určených na liečbu onkologických ochorení, 25 % na liečbu ochorení tráviaceho traktu a porúch metabolizmu, skupiny B, C a H sú zastúpené 8,3 percentami kategorizovaných liekov a v každej zo skupín G, N a V bolo kategorizovaných 4,2 % liekov. Tabuľka 1 vyjadruje pomer kategorizovaných liekov na zriedkavé ocho­renia v SR k registrovaným liekom na zriedkavé ochorenia v EÚ v jednotlivých ATC skupinách.

Po spracovaní dátumov registrácie a kategorizácie liekov na zriedkavé ochorenia sme zistili, že všetky lieky, v rámci jednotlivých ATC skupín, zaostávajú v dostupnosti pre pacientov so zriedkavými ochoreniami v SR o viac ako rok (graf 2). Z celkovo 24 liekov na zriedkavé ochorenia dostupných v SR, zaostáva s kategorizáciou 15 liekov v priemere 14 mesiacov. Ako je zrejmé z grafu 3, mnohé z nich vysoko prevyšujú 12 mesiacov. 12 mesačný limit pre kategorizáciu liekov od ich registrácie splnilo 8 liekov na zriedkavé ochorenia.

 

Výsledky našej analýzy ukázali, že v SR sa zvyšuje reálna dostupnosť liekov na zriedkavé ochorenia a ich úhrada je aj napriek tomu, že patria k najdrahším liekom, 100 percentná. Včasný prístup k týmto liekom môže pacientom s niektorými vzácnymi ochoreniami významne zlepšiť kvalitu života (15). Pre úplné zmapovanie situácie v tejto oblasti bude ale potrebné v našej ďalšej práci zistiť reálny počet pacientov s jednotlivými zriedkavými ochoreniami v SR, ako aj skutočnú spotrebu týchto liekov v SR.

Záver

Analýzou dostupnosti liekov na zriedkavé ochorenia sme sa snažili priblížiť situáciu liečby zriedkavých ochorení v Slovenskej republike a upriamiť pozornosť na nevyhnutnosť riešenia tejto otázky. Za pozitívum považujeme predovšetkým 100% podiel zdravot­ných poisťovní na liečbe týchto život ohrozujúcich, ale aj finančne náročných ochorení. Na druhej strane aj napriek snahám regulačných autorít, jednou z rezerv je práve oneskorená dostupnosť liekov na liečbu zriedkavých ochorení. Keďže podobná analýza nebola v Slovenskej republike doteraz uskutočnená, pred­pokladáme, že by mohla byť prínosom k riešeniu problému terapie pacientov so zriedkavo sa vysky­tujúcimi ochoreniami.

LITERATÚRA

1.    BUTLEN-DUCUING, F., RIVIERE, F., AARUM, S., LLINARES-GARCIA, J.: European Medicines Agency support mechanisms fostering orphan drug development. Drug News Perspect, 23, 2010, č.1, s. 71 – 81.
2.    Regulation (EC) No 141/2000 of the European parliament and of the council. Off J Eur Commun, 43, 2000, L18, s. 1 – 5.
3.    SHAH, R. R.: The latest orphan drug designations and the Commission Communication on regulation (EC) 141/2000. J. Commercial Biotech, 11, 2005, č. 3, s. 228 –238.
4.    Commission regulation (EC) No 847/2000, Off J Eur Commun, 43, 2000, L103, s. 5 – 8.
5.    DEAR J W., LILITKARNTAKUL P., WEBB D. J.: Are rare diseases still orphans or happily adopted? The challenges of developing and using orphan medicinal products Br J Clin Pharmacol, 62, 2006, č. 3, s. 264 – 271.
6.    ENZMANN, H., LÜTZ, J.: European incentives for orphan medicinal products. Bundesgesundheitsblatt Gesundheits­forschung Gesundheitsschutz, 51, 2008, č. 5, s. 500 – 508.
7.    EMA – Londýn, Veľká Británia: http://www.ema.europa.eu
8.    ANONYMUS: Drugs for rare diseases: mixed assessment in Europe. Prescrire Int, 16, 2007, č. 87, s. 36 – 42.
9.    HAFFNER, M.E., TORRENT-FARNELL. J., MAHER, P.D.: Does orphan drug legislation really answer the needs of patients? Lancet, 371, 2008, č. 9629, s. 2041 – 2044.
10.    DENIS, A., MERGAERT, L., FOSTIER, C., CLEEMPUT, I., SIMOENS, S.: Orphan diseases and orphan medicines: a Belgian and European study. J Pharm Belg, 2009, č. 4, s. 131 – 137.
11.    HEEMSTRA, H. E., DE VRUEH, R. L. WEELY, S., BÜLLER, H A., LEUFKENS, H.G.M.: Predictors of orphan drug approval in the European Union. Eur J Clin Pharmacol, 64, 2008, č. 5, s. 545 – 552.
12.    Eurordis: http://www.eurordis.org
13.    Orphanet: http://www.orpha.net
14.    KUŽELOVÁ, M., KUBÁČKOVÁ, K., PALÁGYI, M., ŠMÍD, M.: Nádej pre pacientov so zriedkavo sa vyskytujúcimi ochoreniami – „orphan“ lieky. Čas Lék Čes, 145, 2006, č. 4, s. 296 – 300.
15.    SCHLANDER, M., BECK, M.: Expensive drugs for rare disorders: to treat or not to treat? The case of enzyme replacement therapy for mucopolysaccharidosis VI. Curr Med Res Opin, 25, 2009, č. 5, s. 1285 – 1293.

M. KUŽELOVÁ, L. REPICKÁ, E. ONDRIAŠOVÁ, B. KOVÁCSOVÁ, J. MAZAG, T. FOLTÁNOVÁ
Katedra farmakológie a toxikológie, Farmaceutická fakulta UK, Bratislava,
Štátny ústav pre kontrolu liečiv, Bratislava

Summary

M. Kuželová, L. Repická, E. Ondriašová, B. Kovácsová, J. Mazag, T. Foltánová

HOW FAST CAN PATIENTS WITH RARE DISEASES REACH THEIR THERAPY IN THE SLOVAK REPUBLIC?

The research and development of the drugs for treating rarely occurring diseases with prevalence not more than 5 in 10 000 persons in the European Union (EU) – orphan drugs (OD) have become the priority of the medical and research programs of several EU Member States (1). The aim of this analysis was to identify the availability of OD in the Slovak Republic (SR). We analyzed data from period between May 2004, when SR joined EU, and December 2009. We used data from the European Medicines Agency website (list of authorized orphan drugs) and Slovak Ministry of Health website (categorization list). Further used data were ATC codes, date of authorization and date of implementation into the categorization list. Real availability of the OD was calculated as the difference between date of EU authorization and date of categorization in SR. Up to 1. 1. 2010, 59 OD were granted an EU marketing authorization. The most of the OD were authorized in ATC group L – 27 (45.7%) and group A – 12 (20.3%). In the same period, in SR 24 OD (40.7% of all OD) were categorized; most of them were from ATC group L – 9 (37.5%) and group A – 6 (25%). All OD in SR are 100% reimbursed. However only 8 OD were categorized 12 months after receiving EU authorization. The rest (16 OD) reach the Slovak market with average delay of 14 (1 – 38) months. Although the Slovak healthcare policy is friendly to OD and all OD have 100% reimbursement, less than 50% of OD
reached the market. Our analysis also highlighted that there are still limits in fast OD implementation into the categorization list and thus their real availability.
Key words: orphan drugs – rare diseases – marketing authorization – categorization list

  • P. Křenek, A. Gažová, D. Kučerová, I. Kanková, M. Horváthová, J. Klimas, P. Ochodnický, J. Kyselovič
  • Účinok krátkodobého podávania enalaprilu na masu ľavej komory a expresiu endotelovej NO syntázy u normotenzného potkana
  • Farm Obz, 79, 2010, 8, s. 228-234

Endotelová NO syntáza (eNOS) môže zohrávať protektívnu úlohu v srdci a cievach. Viaceré štúdie popísali zvýšenie jej expresie v srdci a cievach po podávaní ACE inhibítorov (ACEI) za súčasnej korekcie kardiovaskulárneho poškodenia v modeloch kardiovaskulárnych ochorení. Účinky ACE inhibítorov u zdravých potkanov sú menej preskúmané, aj keď by takéto štúdie pomohli objasniť, či je zvýšenie expresie eNOS primárnym účinkom liečiva alebo len sprevádza nápravu patologického stavu. Cieľom tejto práce bolo zhodnotiť účinok enalaprilu na masu ľavej komory a expresiu eNOS a jej negatívneho alosterického modulátora kaveolínu-1 (cav-1) v srdci a aorte normotenzných potkanov bez existujúceho poškodenia. Použili sme potkany Wistar, ktorým sme týždeň podávali enalapril (5 alebo 15 mg/kg/d – E5, E15) v dvoch rozdelených dávkach perorálnou sondou. Kontrolné potkany (K) dostávali vehikulum. Systolický tlak krvi bol meraný tail-cuff metódou. Po utratení sme hodnotili biometrické parametre a expresiu eNOS v ľavej komore a aorte pomocou western blotu. Enalapril nemal vplyv na tepovú frekvenciu a krvný tlak mierne znížil len vo vysokej dávke. Absolútna i relatívna hmotnosť ľavej komory bola znížená oboma dávkami enalaprilu (P<0.05). Expresia eNOS v ľavej komore nebola enalaprilom zmenená, v aorte došlo k jej nesignifikantnému nárastu. Expresia cav-1 nebola zmenená. Naše výsledky naznačujú, že zvýšenie expresie eNOS po ACE inhibítoroch v patologických modeloch nemusí byť primárnym javom, ale zrejme sprevádza nápravu patologického stavu.

Kľúčové slová: ACE inhibítory – endotelová NO syntáza – kaveolín-1 – ľavá komora – aorta.


Úvod

Oxid dusnatý (NO) patrí medzi dôležité regulačné mechanizmy (mediátory) v kardiovaskulárnom sys­téme. Zohráva úlohu pri regulácii cievneho tonusu a krvného tlaku, inhibuje agregáciu doštičiek. Má protektívne účinky, ktoré nesúvisia nevyhnutne s re­dukciou krvného tlaku.Väčšina účinkov NO sa pripisu­je cGMP syntetizovanému cytozolickou guanylylcyklá­zou, ktorú NO aktivuje. Niektoré účinky NO súvisia aj s nitrozyláciou proteínov. NO tiež účinkom na dýchací reťazec znižuje bunkovú respiráciu, čo by mohlo pri fyziologických hladinách NO prispievať k jeho protektívnym účinkom na myokard (1).

Oxid dusnatý je v organizme syntetizovaný tromi izoformami NO syntázy, ktoré katalyzujú premenu  L-arginínu na L-citrulín, pričom vzniká NO. NOS II (iNOS) je indukovateľná, jej expresia sa výrazne zvy­šuje v mnohých bunkových typoch po pôsobení cytokínov a bakteriálnych endotoxínov (2). Dve izoformy sú konštitutívne – NOS I (neuronálna, nNOS) a NOS III (endotelová, eNOS). Ich expresia však nie je konštantná a podlieha viacerým regulačným me­chanizmom (3). Expresia nNOS sa neobmedzuje na neuróny. Je exprimovaná aj v kostrovom svale, macula densa a srdcových myocytoch, za určitých okolností aj v hladkom svale ciev. eNOS sa nachádza najmä v endotelových bunkách, ale aj v srdcových myo­-cytoch. Aktivita iNOS je relatívne nezávislá od vápnika a enzým konštantne produkuje vysoké množstvá NO, ktoré môžu byť až toxické (4). Naproti tomu, aktivita konštitutívnych izoforiem je za bazálnych okolností nízka, výrazne a prechodne vzrastá pri zvýšení cytozolického kalcia (5).

NO produkovaný eNOS má protektívne účinky na kardiovaskulárny systém. Neselektívna systémová inhibícia NO syntáz pomocou látok ako L-NNA alebo L-NAME má za následok poškodenie ciev i myokardu, pričom dochádza k rozvoju vaskulitídy, hypertrofie cievnej steny, perivaskulárnej fibrózy, nekróze myo­cytov a reparačnej fibróze, pričom tieto účinky nie sú nevyhnutne sprostredkované zvýšením krvného tlaku (6). Selektívna farmakologická inhibícia eNOS zatiaľ nie je možná, avšak štúdie s inaktiváciou génu pre eNOS u myší naznačili abnormality v koronárnej hemodynamike, väčšiu náchylnosť k účinkom arytmo­génnych látok (7), zvýšenú citlivosť na ischemicko-reperfúzne poškodenie (8). Po experimentálne na­vo­denom infarkte myokardu bola u eNOS deficientných myší pozorovaná nepriaznivá remodelácia, zníženie kapilárnej denzity, kontraktilná dysfunkcia a zvýšená mortalita (9). Inaktivácia génu pre eNOS u ApoE-de­ficientných myší vedie k výraznej akcelerácii rozvoja spontánnej koronárnej aterosklerózy spojenej s peri­vaskulárnou a myokardiálnou fibrózou, k infarktu myokardu a srdcovému zlyhaniu (10). NO odvodený od eNOS zohráva úlohu aj pri kardioprotektívnych účinkoch niektorých liečiv, čo bolo navrhnuté naprí­klad pri statínoch (11) a suplementácia substrátu pre eNOS L-arginínu zmierňuje štrukturálnu remodeláciu srdca pri experimentálnom diabete (12). Absencia eNOS signifikantne oslabuje dlhodobé kardio­pro­tektívne účinky ACE inhibítorov a antagonistov AT1 receptorov (13, 14).

Účinok ACE inhibície u SHR potkanov je protektív­ny, čoho dôkazom je, že ACE inhibícia (ako aj AT1 blokáda) zdvojnásobuje dĺžku života SHR potkana. Ramipril u starých SHR potkanov pritom zvýšil hla­dinu eNOS proteínu v ľavej komore myokardu a zlep­šil relaxáciu aorty závislú od endotelu (15).

Normalizácia expresie eNOS po ACE inhibícii bola pozorovaná aj pri experimentálnom srdcovom zlyhaní (16, 17), pľúcnej hypertenzii (18), a u pacientov s ischemickou chorobou srdca (19). Nie je však zrejmé, či zvýšenie expresie eNOS je primárnym účinkom, ktorý napomáha zlepšiť patologický stav, alebo sa jedná o sprievodný jav, prípadne, či všetky ACE inhibítory majú túto vlastnosť. Preto sme sa rozhodli hodnotiť vplyv enalaprilu na expresiu eNOS a jej alosterického modulátora cav-1 u normotenzných potkanov, u ktorých poškodenie kardiovaskulárneho systému chýba, a teda možno vylúčiť, že prípadné účinky ACE inhibítorov na expresiu eNOS budú nezávislé od korekcie patologických zmien.

Metódy

Potkany Wistar (veku 18 týždňov) boli chované za štandardných podmienok a dostávali vodu a potravu „ad libitum“. Enalapril hydrochlorid (dar firmy Zentiva) (5 mg/kg/d alebo 15 mg/kg/d) bol podávaný perorálnou sondou počas jedného týždňa, každých 12 hodín v dvoch rozdelených dávkach. Kontrolné zvie­ratá dostávali vehikulum (0,5 % sliz metylcelulózy). Systolický krvný tlak a tepová frekvencia boli merané tail-cuff metódou 3 hodiny a 10 hodín po podaní rannej dávky. Potkany sme utratili pomocou CO2. Komory srdca sme zvážili, aortu sme očistili a vzorky tkanív sme zmrazili v tekutom dusíku a skladovali pri –20 °C až do spracovania.

Expresiu eNOS a cav-1 sme hodnotili Western blot analýzou s chemiluminescenčnou detekciou (ECL Plus, Amersham) a porovnávali ju s expresiou aktínu. V predbežných experimentoch sme si overili, že protilátky proti eNOS a cav-1 a aktínu detekovali jediný pás očakávanej molekulovej hmotnosti, a že expresia aktínu nebola enalaprilom zmenená. Auto­luminogramy eNOS, cav-1 a aktínu sme zoskenovali a denzitometricky vyhodnotili. Hodnotila sa optická denzita škvŕn cav-1 a aktínu, pričom od tejto denzity bola odčítaná denzita pozadia. Vypočítal sa pomer cav-1/aktín, ktorý bol normalizovaný tak, aby kontrolné potkany mali expresiu rovnú jednej, teda 100 %.

Výsledky sú uvádzané ako priemer ± stredná chyba priemeru. Skupiny sme porovnávali pomocou nepá­rového Studentovho t-testu.

Výsledky

Enalapril nemal vplyv na tepovú frekvenciu, ani krvný tlak, s výnimkou vyššej dávky, ktorá tlak znížila po 10 hodinách (obr. 1). Enalapril nezmenil hmotnosť tela, avšak signifikantne znížil absolútnu i relatívnu hmotnosť ľavej komory nezávisle od dávky (obr. 2). Hmotnosť aorty bola po vyššej dávke enalaprilu mier­ne znížená. Expresia eNOS na proteínovej úrovni nebola enalaprilom zmenená v ľavej komore (obr. 3), ani v aorte, kde bol však badateľný trend k zvýšenej expresii (obr. 4). Expresia cav-1 mala podobný priebeh v oboch tkanivách (obr. 3 a 4).

Diskusia

Enalapril znížil masu ľavej komory u normotenz­ných potkanov nezávisle od dávky už po krátkodo­bom, 7-dňovom podávaní, bez výrazného efektu na tlak krvi a expresia eNOS nebola enalaprilom zvýšená ani v ľavej komore, ani v aorte.

 

Na znížení masy ľavej komory sa tak nepodieľala vyššia expresia eNOS, ale iné mechanizmy. Pecháňová a kol. (20) zistila, že kaptopril a enalapril nemenili expresiu eNOS, ale zvyšovali jej aktivitu v srdci a aorte u spontánne hypertenzných potkanov. Tento nárast aktivity by mohol byť spôsobený zvýšením hladín bradykinínu po ACE inhibícii. Zníženie masy ľavej komory nebolo pravdepodobne dôsledkom zníženia tlaku krvi u normotenzných potkanov v našej štúdii, keďže sme pozorovali len minimálny efekt enalaprilu na tlak krvi vo vysokej dávke a masa ľavej komory bola v rovnakej miere znížená aj pri nižšej dávke ACE inhibítora. Je možné, že na rýchlej redukcii masy ľavej komory sa podieľal pokles hladiny angiotenzínu II, ktorý sa dá po podaní enalaprilu predpokladať. Zmeny v expresii rastových faktorov, u ktorých bol popísaný vzťah k angiotenzínu II, sme v predošlých štúdiách nezaznamenali (21).

Nárast expresie eNOS bol po podávaní ACE inhibítorov zistený pri mnohých poškodeniach kardiovaskulárneho systému, napríklad v ľavej komore spontánne hypertenzných potkanov (15), u potkanov s hypertenziou navodenou acetátom deoxykortiko­sterónu a slanou diétou (22), pri liečbe pľúcnej hypertenzie navodenej monokrotalínom (18), u pa­cientov s ochorením koronárnych artérií (23), pri experimentálnom srdcovom zlyhaní (16, 17), ako aj u pacientov s týmto ochorením (19). Proangiogénny efekt a zvýšená expresia eNOS po ACE inhibícii boli zaznamenané u myší s ischémiou dolnej končatiny. Tento účinok bol sprostredkovaný bradykínom cez B2 receptory (24).

Niekoľko prác hodnotilo vplyv ACE inhibítorov na expresiu eNOS aj u normotenzných jedincov bez poškodenia kardiovaskulárneho systému. Ramipril zvýšil expresiu eNOS v aorte normotenzných potka­nov (25). Dĺžka terapie v tomto pokuse bola 5 týždňov, čo je podstatne dlhšie, než 7 dní v našom pokuse. Bachetti a kol. (26) zistili nárast expresie eNOS v aorte normotenzných potkanov liečených quinaprilom. Autori predpokladajú, že kľúčovú úlohu zohrával nárast bradykinínu a aktivácia B2 receptorov, keďže antagonista bradykinínových B2 receptorov icatibant nárast eNOS blokoval. Absencia účinku enalaprilu na expresiu eNOS v našej štúdii môže byť aj dôsledkom toho, že nie všetky ACEI sú v modulovaní NO dráhy ekvivalentné (27).

Najvýraznejší efekt na expresiu eNOS autori pozorovali po liečbe normotenzných potkanov perindoprilom, expresia eNOS bola enalaprilom zvýšená signifikantne, no do menšej miery, než pri perindoprile, napriek podobným účinkom na tlak krvi. V uvedenej práci však bola použitá vyššia dávka enalaprilu (20 mg/kg/d), než v našej štúdii. Viacero experimentov ukazuje, že prinajmenšom niektoré ACE inhibítory sú schopné zvýšiť expresiu eNOS aj in vitro. Zofenoprilát zvyšoval expresiu fibroblastového rastového faktora-2 a eNOS v kultúrach endotelových buniek (28), ako aj tvorbu pseudokapilár z orgánových kultúr prasacích koronárnych artérií. Enalapril bol v tomto ohľade menej účinný - kým zofenoprilát zvýšil expresiu eNOS v endotelových bunkách 17-násobne, enalapril navodil len 1.5 násobný nárast (29).

V našej štúdii sme zmeny expresie kaveolínu-1 v ľavej komore nezaznamenali, v aorte sme pozorovali mierny súčasný nárast expresie eNOS, aj kaveolínu-1. Kaveolín-1, ktorý je negatívnym alosterickým modu­látorom eNOS, znižuje aktivitu eNOS v nestimulova­ných endotelových bunkách (30), ale na druhej strane paradoxne uľahčuje aktiváciu eNOS tým, že ju sekvestruje do kaveol, kde sú sústredené aj ďalšie signálne molekuly, vrátane bradykinínových B2 receptorov. eNOS je tak v tesnej blízkosti receptorov, ktoré sú zodpovedné za jej aktiváciu (31). Práce popisujúce vplyv inhibície renín-angiotenzínového systému na expresiu kaveolínu-1 prakticky absentujú, napriek tomu, že boli popísané interakcie kaveolínu-1 s AT1 receptorom (32). U diabetických myší zofenopril a enalapril znížili expresiu cav-1 a zvýšili produkciu NO (33). AT1 blokátor candesartan zvýšil expresiu eNOS a cav-1 v srdci potkanov s hypertenziou navodenou infúziou angiotenzínu II (16). Niektoré štúdie podporujú hypotézu, že kaveolín-1 by mohol mať inhibičný vplyv na trofický status myokardu. Myši s chýbajúcou expresiou kaveolínu-1 majú hypertrofiu myokardu (34), podávanie bunkovo permeabilného peptidu odvodeného od kaveolínu-1 vedie k regresii hypertrofie pravej komory pri pľúcnej hypertenzii navodenej, monokrotalínom, a to pravdepodobne nezávisle od redukcie tlaku v pľúcnej artérii (35). Expresia kaveolínu-1 v srdci bola znížená aj v niekto­rých modeloch hypertrofie myokardu, napríklad  psov s hypertrofickou kardiomyopatiou (36) alebo u spontánne hypertenzných potkanov (37).

Záverom možno zhrnúť, že rýchla redukcia masy ľavej komory po 7-dňovom podávaní enalaprilu normotenzným potkanom nebola spôsobená znížením tlaku krvi, ani zvýšením expresie eNOS alebo kaveo­línu-1. Absencia účinku enalaprilu na expresiu eNOS bola reprodukovateľná, ale na základe literárnych údajov o podávaní ACE inhibítorov, neočakávaná. Je možné, že zvýšenie expresie eNOS patrí medzi účinky, ktoré nemajú všetky ACE inhibítory, alebo sa prejaví až po dlhšom podávaní. Istou limitáciou štúdie je, že nemožno na základe našich údajov vylúčiť účasť eNOS na znížení masy ľavej komory, keďže sme merali len expresiu, nie však aktivitu eNOS.

Poďakovanie
Táto práca bola podporená grantami 1/0357/09, 1/0377/09, 1/0707/09.

Literatúra

1.    ILANGOVAN, G., OSINBOWALE, S., BRATASZ, A., BONAR, M., CARDOUNEL, A.J., ZWEIER, J.L., KUPPUSAMY, P.: Heat shock regulates the respiration of cardiac H9c2 cells through upregulation of nitric oxide synthase. Am J Physiol, 287, 2004, č. 5, s. C1472 – C1481.
2.    KLEINERT, H., SCHWARZ, P.M., FORSTERMANN, U.: Regulation of the expression of inducible nitric oxide synthase. Biol Chem, 384, 2003, č. 10-11, s. 1343 – 1364.
3.    FORSTERMANN, U., BOISSEL, J.P., KLEINERT, H.: Expressional control of the ‚constitutive‘ isoforms of nitric oxide synthase (NOS I and NOS III). FASEB J, 12, 1998, č. 10, s. 773 – 790.
4.    VALLANCE, P., MONCADA, S.: Role of endogenous nitric oxide in septic shock. New Horiz, 1, 1993, č. 1, s. 77 – 86.
5.    BREDT, D.S., SNYDER, S.H.: Isolation of nitric oxide synthetase, a calmodulin-requiring enzyme. Proc Natl Acad Sci U S A, 87, 1990, č.2, s. 682 – 685.
6.    ZATZ, R., BAYLIS, C.: Chronic nitric oxide inhibition model six years on. Hypertension, 32, 1998, č. 6, s. 958 – 964.
7.    KUBOTA, I., HAN, X., OPEL, D.J., ZHAO, Y.Y., BALIGA, R., HUANG, P., FISHMAN, M.C., SHANNON, R.P., MICHEL, T., KELLY, R.A.: Increased susceptibility to development of triggered activity in myocytes from mice with targeted disruption of endothelial nitric oxide synthase. J Mol Cell Cardiol, 32, 2000, č. 7, s. 1239 – 1248.
8.    SUMERAY, M.S., REES, D.D., YELLON, D.M.: Infarct size and nitric oxide synthase in murine myocardium. J Mol Cell Cardiol, 32, 2000, č. 1, s. 35 – 42.
9.    SCHERRER-CROSBIE, M., ULLRICH, R., BLOCH, K.D., NAKAJIMA, H., NASSERI, B., ARETZ, H.T., LINDSEY, M.L., VANCON, A.C., HUANG, P.L, LEE, R.T., ZAPOL, W.M., PICARD, M.H.: Endothelial nitric oxide synthase limits left ventricular remodeling after myocardial infarction in mice. Circulation, 104, 2001, č. 11, s. 1286 – 1291.
10.    KUHLENCORDT, P.J., GYURKO, R., HAN, F., SCHERRER-CROSBIE, M., ARETZ, T.H., HAJJAR, R., PICARD, M.H., HUANG, P.L.: Accelerated atherosclerosis, aortic aneurysm formation, and ischemic heart disease in apolipoprotein E/endothelial nitric oxide synthase double-knockout mice. Circulation, 104, 2001, č. 4, s. 448 – 454.
11.    ADAMEOVA, A., HARCAROVA, A., MATEJIKOVA, J., PANCZA, D., KUZELOVA, M., CARNICKA, S., SVEC, P., BARTEKOVA, M., STYK, J., RAVINGEROVÁ, T.: Simvastatin alleviates myocardial contractile dysfunction and lethal ischemic injury in rat heart independent of cholesterol-lowering effects. Physiol Res, 58, 2009, č. 3,
s. 449 – 454.
12.    OKRUHLICOVA, L., SOTNÍKOVA, R., STEFEK, M., TRIBULOVA, N., WEISMANN, P., GAJDOSÍK, A., GAJDOSÍKOVA, A.: L-arginine reduces structural remodeling in the diabetic rat myocardium. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 24, 2002, č. 4, s. 201 – 207.
13.    YANG, X.P., LIU, Y.H., SHESELY, E.G., BULAGANNAWAR, M., LIU, F., CARRETERO, O.A.: Endothelial nitric oxide gene knockout mice: cardiac phenotypes and the effect of angiotensin-converting enzyme inhibitor on myocardial ischemia/reperfusion injury. Hypertension, 34, 1999, č. 1, s. 124 – 130.
14.    LIU, Y.H., XU, J., YANG, X.P., YANG, F., SHESELY, E., CARRETERO, O.A.: Effect of ACE inhibitors and angiotensin II type 1 receptor antagonists on endothelial NO synthase knockout mice with heart failure. Hypertension, 39, 2002, č. 2 Pt 2, s. 375 – 381.
15.    LINZ, W., WOHLFART, P., SCHOELKENS, B.A.,
BECKER, R.H., MALINSKI, T., WIEMER, G.: Late treatment with ramipril increases survival in old spontaneously hypertensive rats. Hypertension, 34, 1999, č. 2, s. 291 – 295.
16.    KOBAYASHI, N., HIGASHI, T., HARA, K., SHIRATAKI, H., MATSUOKA, H.: Effects of imidapril on NOS expression and myocardial remodelling in failing heart of Dahl salt-sensitive hypertensive rats. Cardiovasc Res, 44, 1999, č. 3, s. 518 – 526.
17.    SCHÄFER, A., FRACCAROLLO, D., TAS, P., SCHMIDT, I., ERTL, G., BAUERSACHS, J.: Endothelial dysfunction in congestive heart failure: ACE inhibition vs. angiotensin II antagonism. Eur J Heart Fail, 6, 2004, č. 2, s. 151 – 159.
18.    KANNO, S., WU, Y.J., LEE, P.C., BILLIAR, T.R., HO, C.: Angiotensin-converting enzyme inhibitor preserves p21 and endothelial nitric oxide synthase expression in monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension in rats. Circulation, 104, 2001, č. 8, s. 945 – 950.
19.    MORAWIETZ, H., ROHRBACH, S., RUECKSCHLOSS, U., SCHELLENBERGER, E., HAKIM, K., ZERKOWSKI, H.R., KOJDA, G., DARMER, D., HOLTZ, J.: Increased cardiac endothelial nitric oxide synthase expression in patients taking angiotensin-converting enzyme inhibitor therapy. Eur J Clin Invest, 36, 2006, č. 10, s. 705 – 12.
20.    PECHÁŇOVÁ, O.: Contribution of captopril thiol group to the prevention of spontaneous hypertension. Physiol Res, 56, 2007, Suppl 2, s. S41 – S48.
21.    KŘENEK, P., MACKOVIČOVÁ, K., OCHODNICKÝ, P., GAŽOVÁ, A., KLIMAS, J., MUSIL, P., KYSELOVIČ, J.: ACE inhibition rapidly decreases cardiac mass but does not affect expression of growth factors inthe normotensive rat. Journal of Hypertension, 27, 2009, suppl. 4, s. S455.
22.    HARA, K., KOBAYASHI, N., WATANABE, S.,
TSUBOKOU, Y., MATSUOKA, H.: Effects of quinapril on expression of eNOS, ACE, and AT1 receptor in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. Am J Hypertens, 14, 2001, č. 4, s. 321 – 330.
23.    ZHUO, J.L., MENDELSOHN, F.A., OHISHI, M.: Perindopril alters vascular angiotensin-converting enzyme, AT(1) receptor, and nitric oxide synthase expression in patients with coronary heart disease. Hypertension, 39, 2002, č. 2 Pt 2, s. 634 – 638.
24.    SILVESTRE, J.S., BERGAYA, S., TAMARAT, R., DURIEZ, M., BOULANGER, C.M., LEVY, B.I.: Proangiogenic effect of angiotensin-converting enzyme inhibition is mediated by the bradykinin B(2) receptor pathway. Circ Res, 89, 2001, č. 8, s. 678 – 683.
25.    FONTAINE, D., FONTAINE, J., DUPONT, I., DESSY, C., PIECH, A., CARPENTIER, Y., BERKENBOOM, G.: Chronic hydroxymethylglutaryl coenzyme a reductase inhibition and endothelial function of the normocholesterolemic rat: comparison with angiotensin-converting enzyme inhibition. J Cardiovasc Pharmacol, 40, 2002, č. 2, s. 172 – 180.
26.    BACHETTI, T., COMINI, L., PASINI, E., CARGNONI, A., CURELLO, S., FERRARI, R.: Ace-inhibition with quinapril modulates the nitric oxide pathway in normotensive rats. J Mol Cell Cardiol, 33, 2001, č. 3, s. 395 – 403.
27.    COMINI, L., BACHETTI, T., CARGNONI, A., BAS­TIA­NON, D., GITTI, G.L., CECONI, C., FERRARI, R.: Thera­peutic modulation of the nitric oxide: all ace inhibitors are not equivalent. Pharmacol Res, 56, 2007, č. 1, s. 42 – 48.
28.    DONNINI, S., TERZUOLI, E., ZICHE, M., MORBIDELLI, L.: Sulfhydryl angiotensin-converting enzyme inhibitor promotes endothelial cell survival through nitric-oxide synthase, fibroblast growth factor-2, and telomerase cross-talk. J Pharmacol Exp Ther, 333, 2010; č. 3, s. 776 – 784.
29.    DONNINI, S., SOLITO, R., GIACHETTI, A., GRANGER, H.J., ZICHE, M., MORBIDELLI, L.: Fibroblast growth factor-2 mediates Angiotensin-converting enzyme inhibitor-induced angiogenesis in coronary endothelium. J Pharmacol Exp Ther, 319, 2006, č. 2, s. 515 – 522.
30.    MICHEL, J.B., FERON, O., SACKS, D., MICHEL, T.: Reciprocal regulation of endothelial nitric-oxide synthase by Ca2+-calmodulin and caveolin. J Biol Chem, 272, 1997, č. 25, s. 5583 – 5586.
31.    GOLIGORSKY, M.S., LI, H., BRODSKY, S., CHEN, J.: Relationships between caveolae and eNOS: everything in proximity and the proximity of everything. Am J Physiol Renal Physiol, 283, 2002, č.1, s. F1 – F10.
32.    ISHIZAKA, N., GRIENDLING, K.K., LASS?GUE, B., ALEXANDER, R.W.: Angiotensin II type 1 receptor: rela­tionship with caveolae and caveolin after initial agonist stimulation. Hypertension, 32, 1998, č. 3, s. 459 – 466.
33.    BUCCI, M., ROVIEZZO, F., BRANCALEONE, V., DI LORENZO, A., EVANGELISTA, S., GORI, M., CIRINO, G.: ACE-inhibition ameliorates vascular reactivity and delays diabetes outcome in NOD mice. Vascul Pharmacol, 49, 2008, č. 2-3, s. 84 – 90.
34.    KOBAYASHI, N., MORI, Y., NAKANO, S., TSUBOKOU, Y., KOBAYASHI, T., SHIRATAKI, H., MATSUOKA, H.: TCV-116 stimulates eNOS and caveolin-1 expression and improves coronary microvascular remodeling in normotensive and angiotensin II-induced hypertensive rats. Atherosclerosis, 158, 2001, č. 2, s. 359 – 368.
35.    COHEN, A.W., PARK, D.S., WOODMAN, S.E., WILLIAMS, T.M., CHANDRA, M., SHIRANI, J., SOUZA, A.P., KITSIS, R.N., RUSSELL, R.G., WEISS, L.M., TANG, B., JELICKS, L.A., FACTOR, S.M., SHTUTIN, V., TANOWITZ, H.B., LISANTI, M.P.: Caveolin-1 null mice develop cardiac hypertrophy with hyperactivation of p42/44 MAP kinase in cardiac fibroblasts. Am J Physiol, 284, 2003, č. 2, s. C457 – C474.
36.    JASMIN, J.F., MERCIER, I., DUPUIS, J., TANOWITZ, H.B., LISANTI, M.P.: Short-term administration of a cell-permeable caveolin-1 peptide prevents the development of monocrotaline-induced pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy. Circulation, 114, 2006, č. 9, s. 912 – 920.
37.    PIECH, A., DESSY, C., HAVAUX, X., FERON, O., BALLIGAND, J.L.: Differential regulation of nitric oxide synthases and their allosteric regulators in heart and vessels of hypertensive rats. Cardiovasc Res, 57, 2003, č. 2, s. 456 – 467.
38.    PIECH, A., MASSART, P.E., DESSY, C., FERON, O., HAVAUX, X., MOREL, N., VANOVERSCHELDE, J.L., DONCKIER, J., BALLIGAND, J.L.: Decreased expression of myocardial eNOS and caveolin in dogs with hypertrophic cardiomyopathy. Am J Physiol, 282, 2002,
č. 1, s. H219 – H231.

P. Křenek,  A. Gažová, D. Kučerová, I. Kanková, M. Horváthová ,J. Klimas, P. Ochodnický,  J. Kyselovič
Farmaceutická fakulta Univerzity Komenského, Katedra farmakológie a toxikológie, Bratislava
Lekárska fakulta Univerzity Komenského, Ústav farmakológie a klinickej farmakológie, Bratislava

Summary


P. Křenek, A. Gažová, D. Kučerová, I. Kanková, M. Horváthová, J. Klimas, P. Ochodnický, J. Kyselovič

Effect of short-term application of enalapril on left ventricular mass and expression of NO synthase in normotensive rat

Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) may play protective roles in the heart and vessels. Several studies described an increased expression of eNOS after ACE inhibitor administration, concomitantly with the correction of cardiovascular damage in models of cardiovascular diseases. Effects of ACE inhibitors in healthy rats are less well described, although such studies could shed more light into distinction whether eNOS upregulation is a primary effect of the drug or it just accompanies the correction of the pathological state. The aim of this study was to evaluate the effect of enalapril on the left ventricular mass and expression of eNOS and its negative allosteric regulator caveolin-1 (cav-1) in the heart and aorta of rats without pre-existing cardiovascular damage. Male Wistar rats were gavaged with enalapril (5 or 15 mg/kg/d - E5, E15) in two divided doses for one week. Control rats (K) received the vehicle. Systolic blood pressure and heart rate were measured by the tail-cuff method. After sacrifice, we measured left ventricular mass and expression of eNOS in the left ventricle and aorta using western blot. Enalapril had no effect on heart rate and blood pressure was decreased slightly only by the high dose of the drug. Relative left ventricular mass was decreased by both doses of enalapril (P<0.05). Expression of eNOS in the left ventricle was not changed by enalapril, a small insignificant increase was observed in the aorta. Expression of cav-1 was not altered. We assume that increased expression of eNOS after ACE inhibition in pathological models is probably not a primary phenomenon, but may rather accompany the correction of cardiovascular damage.
Keywords: ACE inhibitors, endothelial nitric oxide synthase, caveolin-1, left ventricle, aorta.

  • L. Mésarošová, J. Švihra, S. Fraňová, A. Hrabovská, P. Křenek, J. Kyselovič, P. Ochodnický
  • Úloha kaveolínu 1  v procese proliferácie svetlobunkového adenokarcinómu obličiek
  • Farm Obz, 79, 2010, 8, s. 219-222

Adenokarcinóm obličiek (RCC- renal cell carcinoma) je najbežnejším nádorovým ochorením obličiek. Tvorí 3 % zo všetkých nádorových ochorení. Pacienti sú pri stanovení diagnózy často v pokročilom štádiu ochorenia a 20 – 30 % pacientov je postihnutých metastázami. V tumorových a kontrolných vzorkách pacientov, ktorí sa podrobili radikálnej nefrektómii, sa študovali zmeny expresie kaveolínu-1 prostred­níctvom metódy Western blot. Zmeny expresie boli porovnané s TNM klasifikáciou a Fuhrmanovej nukleárnym gradingom tumorov. V tumoroch sme pozorovali signifikantnú nadprodukciu kaveolínu 1 v porovnaní s kontrolným tkanivom. Skupinu pacientov sme rozdelili na základe TNM klasifikácie do štyroch skupín T1a, T1b, T3a a T3b a Fuhrmanovej nukleárneho gradingu do skupín G1, G2 a G3. Zaznamenali sme signifikantnú expresiu kaveolínu 1 v T1a stupni podľa TNM klasifikácie a v G1 G2 stupni Fuhrmanovej gradingu v porovnaní s kontrolou. Pozorovali sme nadmernú expresiu kaveolínu 1 u pacientov s proliferačným koeficientom 10%. Kaveolín 1 sa môže podielať na angiogenéze a rozvoji nádorovej masy. Jeho vysoké hladiny by mohli slúžiť ako indikátor závažnosti ochorenia adenokarcinómu obličiek.

Kľúčové slová: adnokarcinóm obličiek - kaveolín 1 – TNM klasifikácia – Fuhrmanovej nukleárny grading - PCNA


Úvod

Adenokarcinóm obličiek (RCC- renal cell carcinoma) je najčastejším nádorovým ochorením obličiek v dospe­lom vek. Tvorí až 3 % zo všetkých malignít a prináleží mu celosvetovo 100 000 úmrtí ročne (1). Najčastejším podtypom je svetlobukový adenokarcinóm 70 %, papilárny adenokarcinóm prestavuje 10 – 15 %, karcinóm zberných kanálikov 1 % a neklasifikované typy adenokarcinómu 4 – 5 % (2). RCC jedným z tera­peuticky najrezistentnejších tumorov, cytostatiká sú v podstate neúčinné a jediným efektívnym tera­peutickým prístupom je chirurgická liečba, radikálna nefrektómia, prípadne nefróny-šetriaca chirurgia. Úspech týchto prístupov však závisí od štádia ochore­nia (klinicky charakterizovaného TNM klasifikáciou), a keďže prakticky chýbajú účinné diagnostické mar­kery, vyše 30 % pacientov je diagnostikovaných v štá­diu metastáz (3).

Kaveoly sú definované ako invaginácie plazmatickej membrány s veľkosťou 50 – 100 nm (4). Gleeney a Zokas (1989) izolovali z v-Src-transformovaných buniek (virus sarcoma Rous cell) 4 predominantné proteíny selektívne fosforylované na tyrozínovom zvyšku. Jedným z týchto proteínov bola aj 22 kDa veľká molekula rezistentná na extrakciu Tritonom

X-100. Imunoelektrónová mikroskopia potvrdila spojitosť medzi 22 kDa proteínom a kaveolami a bol pomenovaný kaveolín (cav) (5). Kaveolíny sú proteíny, ktoré patria do rodiny integrálnych membránových proteínov (6). Zúčastňujú sa na mnohých fyziologic­kých procesoch, medzi ktoré patrí endocytóza, homeostáza cholesterolu a lipidov, prenos signálov, supresia tumorov ale zúčastňujú sa aj na metastázovaní tumorov (7).

Materiál a metódy

V predloženej štúdii boli použité na stanovenie zmeny expresie kaveolínu-1 tumorové a kontrolné tkanivá od pacientov s diagnózou adenokarcinómu obličiek. V štúdii bolo použitých 27 tumorových a 27 kontrolných vzoriek od pacientov po radikálnej nefrektómii. Pacienti boli vo veku od 38 do 82 rokov, z toho 7 bolo žien a 20 muži. Pätnástim z nich bola odobratá pravá a dvanástim ľavá oblička. Stupeň TNM klasifikácie bol stanovený patológom a pohyboval sa od T1 po T3, Fuhrmanovej grading bol stanovený prostredníctvom imunohistochémie a pohyboval sa od G1 po G3 a angioinvázia bola pozitívna u 23 pacientov. Pacienti boli operovaný na Urologickej klinike Fakult­nej nemocnice v Martine. Zmeny expresie kaveolínu-1 sa študovali prostredníctvom metódy Western blot. Ako primárna protilátka proti kaveolínu-1 bola použitá anti-kaveolín-1. Primárna protilátka bola nariedená v pomere 1 : 1500 v 1% mlieku. Po primárnej protilátke sa membrána premývala v TBS-T (Tris-Buffered Saline Tween-20) a inkubovala sa so sekundárnou protilátkou značenou peroxidázou. Sekundárnou protilátkou proti kaveolín-1 bola anti-mouse IgG-HRP, nariedená v po­mere 1 : 10 000 v TBST. Blot sa exponoval na RTG film. Expozičný čas pre kaveolín-1 bol 60 minút. Autoluminogram proteínu sa spracoval v programe Optiquant (Packard Instruments). Hodnotila sa optická denzita škvŕn proteínu, pričom od tejto denzity sa odčíta denzita pozadia. V práci sa výsledky uvádzajú ako priemer ± stredná chyba priemeru (SEM). Na hodnotenie rozdielov sme použil nepárový Studentov t-test. Hodnoty p < 0,05 boli považované za signifikantné.

Výsledky

Sledovaním expresie cav-1 sme zaznamenali viditeľ­né zmeny v expresii kaveolínu 1 v tumorových tkanivách v porovnaní s kontrolnými tkanivami (obr. 1A). Vzorky označené ako KP (kontrola) a TP (tumor) boli od pacienta s diagnózou papilárny podtyp adenokarcinómu obličiek (PRCC). Expresia kaveolínu 1 bola zaznamenaná iba vo svetlobunkovom podtype RCC (obr. 1B). Tieto vzorky neboli ďalej použité v štatistickom vyhodnocovaní.

V tumorových tkanivách bolo zaznamenané zvýše­nie expresie kaveolínu 1 vzhľadom ku kontrole (tumor 1998 ± 423 %, kontrola 100 ± 50, p < 0,05) (obr. 2). Súbor pacientov bol rozdelený do štyroch skupín podľa TNM klasifikácie na štádiá T1a, T1b, T3a a T3b. Zaznamenali sme signifikantné zvýšenie expresie kaveolínu 1 v štá­diu T1a (tumor T1a 1595 ± 553, kontrola T1a 63 ± 31, p < 0,05) (obr. 3). Vzťah medzi zmenou expresie kaveo­línu 1 a stupňom Fuhrmanovej gradingu bola preukázateľná v štádiách G1 a G2 (G1 tumor 1932 ± 596, kontrola 42 ± 26, p < 0,05; G2 tumor 2284 ± 658, kontrola 101 ± 65, p < 0,05) (obr. 4). Zmeny expresie kaveolínu 1 sme porovnali s proliferačnou aktivitou (PCNA) jednotlivých pacientov. Zaznamenali sme sig­nifikantné zvýšenie expresie kaveolínu 1 u pacientov s proliferačnou aktivitou 10 % (obr. 5).

Diskusia

Výsledky uvedené v tejto práci boli získané na základe vyhodnotenia klinických údajov 42 pacientov s diagnózou adenokarcinómu obličiek. Metódou Wes­tern blot sme sledovali expresiu cav-1 v kontrolnom a tumorovom tkanive. Výsledky boli porovnané s TNM klasifikáciou a Guhrmanovej gradingom.

Kaveolíny sa zúčastňujú na patogenéze mnohých ľudských nádorov, ako napríklad epiteliálne nádory, rakovina pľúc, rakovina gastrointestinálneho traktu, prostaty, vaječníkov a RCC (8). Kľúčovým procesom nádorových buniek je migrácia buniek, ktorá je základným procesom angiogenézy a metastázovania (9). Je známe, že kaveolín 1 má funkciu tumor-supresora, ktorý inhibuje aktivitu mnohým proto­onkogénov. Veľa predchádzajúcich štúdií sledovalo nízku expresiu kaveolínu 1 v tumorových bunkách, čím potvrdili hypotézu kaveolínu 1 ako tumor-supresora (10). Naše výsledky však poukazujú na nadmernú produkciu kaveolínu 1 v tumorových tkanivách v porovnaní s kontrolným tkanivom. Záro­veň sme dokázali špecifickosť expresie kaveolínu 1 vo svetlobunkovom podtype RCC. Hypotézu tumor-supresora sme mohli preto vylúčiť. Wu a Terian poukazujú na nadmernú expresiu kaveolínu 1 pri rakovine prostaty. V procese metastázovania bola v častiach primárneho tumoru sledovaná nadmerná expresia kaveolínu 1 (11). Preto sa môžeme domnievať, že kaveolín 1 nemá v tomto prípade funkciu tumor-supresora, ale sa zúčastňuje na procese rastu nádorovej masy čomu nasvedčuje aj nadmerná expresia kaveo­línu 1 u pacientov so zvýšeným PCNA.

Porovnaním našich výsledkov s TNM klasifikáciou a Fuhrmanovej gradingom sme zaznamenali zmeny expresie kaveolínu 1 v jednotlivých stupňoch. Sledo­vali sme signifikantný nárast expresie kaveolínu 1 v tumorových tkanivách v stupni T1a TNM klasifikácie a v stupni G1 a G2 Fuhrmanovej gradingu v porovnaní s kontrolným tkanivom. Najväčšie rozdiely sme sledovali v T1a stupni TNM, preto by mohol kaveolín 1 slúžiť ako indikátor závažnosti ochorenia adeno­karcinómu obličiek.
Táto práca vznikla za podpory grantu VEGA 1/0103/09 a VEGA 1/0707/09.

LITERATÚRA

1.    VOGELYANG, N.J., STADLER, W.M.: Kidney cancer. Lancet, 9141, 1998, č. 352, s.1691-1696.
2.    STORKEL, S., EBLE, J.N., ADLAKHA, K., et al.: Classification of renal cell carcinoma. Workgroup No. 1. Union Internationale Contre le Cancer (UICC) and the American Joint Committee on Cancer (AJCC). Cancer (Phila), 80, 1997, č. 5, s. 987–989.
3.     RATHMELL, W.K., MARTZ, C.A., RINI, B.I.: Renal cell carcinoma. Curr Opin Oncol, 19, 2007, č. 3, s. 234-240.
4.    KURZCHALIA, T.V., PARTON, R.G.: Membrane microdomains and caveola. Curr Opin Cell Biol, 11, 1999, č. 4, s. 424-431.
5.     ROTHBERG, K.G., HEUSER, J.E., DONZELL, W.C., et al.: Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell, 68, 1992, č. 4, s. 673-682.
6.    ENGELMAN, J.A., ZHANG, X., GALBIATI, F., VOLONTE, D., SOTGIA, F., PESTELL, R.G., MINETTI, C., SCHERER, P.E., OKOMATA, T., LISANTI, M.P.: Molecular genetics of the caveolin gene family: implications for human cancers, diabetes, Alzheimer disease, and muscular dystrophy. Am.J.Hum. Genet., 63, 1998, č. 6, s. 1578-1587.
7.    COHEN, A.W., RAZANI, B., WANG, X.B., COMBS, T.P., WILLIAMS, T.M., SCHERER, P.E., LISANTI, M.P.: Caveolin-1-deficient mice show insulin resistance and defective insulin receptor protein expression in adipose tissue. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2003, č. 285,
s. C222-C235.
8.    WILLIAMS, T.M., CHEUNG, M.W., PARK, D.S., RAZANI, B., COHEN, A.W., MULLER, W.J., DI VIZIO, D., CHOPRA, N.G., PESTELL, R.G., LISANTI, M.P.: Loss of caveolin-1 gene expression acceleratesthe development of dysplastic mammary lesion in tumor- prone transgenic mice. Mol Biol Cell, 14, 2003, č. 3, s. 1027-1042.
9.    GÁLVEZ, B.G. et al. : Caveolae are a novel pathway for a membrane- type 1 matrix metalloproteinase traffic in human endothelial cells. Molecular Biology of the Cell, 15, 2004, č. 2, s. 678-687.
10.    ENGELMA, J.A., WYCOFF, C.C., YASUHARA, S., SONG, K.S., OKAMATA, T., LISANTI, M.P.: Recombinant expresion of caveolin-1 in oncogenically transformed cells abrogates anchorage-indepedent growth. J Biol. Chem., 272, 1997, č. 26, s. 16374-16381.
11.    WU, D., TERRIAN, D.M.: Regulation of caveolin 1 expression and secretion by a protein kinase C (PKC) epsilon signaling pathway in human prostate cancer cells. J Biol Chem, 277, 2002, č. 43, s. 40449-40455.

L. MÉSAROŠOVÁ, J. ŠVIHRA, S. FRAŇOVÁ, A. HRABOVSKÁ, P. KŘENEK, J. KYSELOVIČ, P. OCHODNICKÝ
Ústav farmakológie, Jesseniova lekárska fakulta UK, Martin
Urologická klinika fakultnej nemocnice UK, Martin
Katedra farmakológie a toxikológie, Farmaceutická fakulta UK, Bratislava

Summary

L. Mésarošová, J. Švihra, S. Fraňová, A. Hrabovská, P. Křenek, J. Kyselovič, P. Ochodnický

Role of caveolin 1 in proliferation process of clear cell renal cell carcinoma of kidney

Renal cell carcinoma is the most common malignant of the kidney. It accounts for 3% of all adult malignancies. The 20-30% of patients are often diagnosed with metastatic disease. Samples of tumor and healthy tissues obtained from patients by radical nephrectomy were used to determine the expression of caveolin 1 by Western blot. Changes of the expression level were correlated with TNM classification and Fuhrman nuclear grading of the tumors. Patients were devided in to the groups according the TNM classification and Fuhrman´s grading. We observed overexpresion of caveolin 1 in the stages T1a of TNM and G1, G2 of Fuhrman´s grading. Patients with 10% proliferation activity had high expression level of caveolin 1. Caveolin 1 may participate in the growth of tumors cell and angiogenesis and could be used as a biomarker of renal cell carcinoma.
Key words: renal cell carcinoma – caveolin 1- TNM classification – Fuhrman´s grading – PCNA.

Partneri