• L. Mésarošová, J. Švihra, S. Fraňová, A. Hrabovská, P. Křenek, J. Kyselovič, P. Ochodnický
  • Úloha kaveolínu 1  v procese proliferácie svetlobunkového adenokarcinómu obličiek
  • Farm Obz, 79, 2010, 8, s. 219-222

Adenokarcinóm obličiek (RCC- renal cell carcinoma) je najbežnejším nádorovým ochorením obličiek. Tvorí 3 % zo všetkých nádorových ochorení. Pacienti sú pri stanovení diagnózy často v pokročilom štádiu ochorenia a 20 – 30 % pacientov je postihnutých metastázami. V tumorových a kontrolných vzorkách pacientov, ktorí sa podrobili radikálnej nefrektómii, sa študovali zmeny expresie kaveolínu-1 prostred­níctvom metódy Western blot. Zmeny expresie boli porovnané s TNM klasifikáciou a Fuhrmanovej nukleárnym gradingom tumorov. V tumoroch sme pozorovali signifikantnú nadprodukciu kaveolínu 1 v porovnaní s kontrolným tkanivom. Skupinu pacientov sme rozdelili na základe TNM klasifikácie do štyroch skupín T1a, T1b, T3a a T3b a Fuhrmanovej nukleárneho gradingu do skupín G1, G2 a G3. Zaznamenali sme signifikantnú expresiu kaveolínu 1 v T1a stupni podľa TNM klasifikácie a v G1 G2 stupni Fuhrmanovej gradingu v porovnaní s kontrolou. Pozorovali sme nadmernú expresiu kaveolínu 1 u pacientov s proliferačným koeficientom 10%. Kaveolín 1 sa môže podielať na angiogenéze a rozvoji nádorovej masy. Jeho vysoké hladiny by mohli slúžiť ako indikátor závažnosti ochorenia adenokarcinómu obličiek.

Kľúčové slová: adnokarcinóm obličiek - kaveolín 1 – TNM klasifikácia – Fuhrmanovej nukleárny grading - PCNA


Úvod

Adenokarcinóm obličiek (RCC- renal cell carcinoma) je najčastejším nádorovým ochorením obličiek v dospe­lom vek. Tvorí až 3 % zo všetkých malignít a prináleží mu celosvetovo 100 000 úmrtí ročne (1). Najčastejším podtypom je svetlobukový adenokarcinóm 70 %, papilárny adenokarcinóm prestavuje 10 – 15 %, karcinóm zberných kanálikov 1 % a neklasifikované typy adenokarcinómu 4 – 5 % (2). RCC jedným z tera­peuticky najrezistentnejších tumorov, cytostatiká sú v podstate neúčinné a jediným efektívnym tera­peutickým prístupom je chirurgická liečba, radikálna nefrektómia, prípadne nefróny-šetriaca chirurgia. Úspech týchto prístupov však závisí od štádia ochore­nia (klinicky charakterizovaného TNM klasifikáciou), a keďže prakticky chýbajú účinné diagnostické mar­kery, vyše 30 % pacientov je diagnostikovaných v štá­diu metastáz (3).

Kaveoly sú definované ako invaginácie plazmatickej membrány s veľkosťou 50 – 100 nm (4). Gleeney a Zokas (1989) izolovali z v-Src-transformovaných buniek (virus sarcoma Rous cell) 4 predominantné proteíny selektívne fosforylované na tyrozínovom zvyšku. Jedným z týchto proteínov bola aj 22 kDa veľká molekula rezistentná na extrakciu Tritonom

X-100. Imunoelektrónová mikroskopia potvrdila spojitosť medzi 22 kDa proteínom a kaveolami a bol pomenovaný kaveolín (cav) (5). Kaveolíny sú proteíny, ktoré patria do rodiny integrálnych membránových proteínov (6). Zúčastňujú sa na mnohých fyziologic­kých procesoch, medzi ktoré patrí endocytóza, homeostáza cholesterolu a lipidov, prenos signálov, supresia tumorov ale zúčastňujú sa aj na metastázovaní tumorov (7).

Materiál a metódy

V predloženej štúdii boli použité na stanovenie zmeny expresie kaveolínu-1 tumorové a kontrolné tkanivá od pacientov s diagnózou adenokarcinómu obličiek. V štúdii bolo použitých 27 tumorových a 27 kontrolných vzoriek od pacientov po radikálnej nefrektómii. Pacienti boli vo veku od 38 do 82 rokov, z toho 7 bolo žien a 20 muži. Pätnástim z nich bola odobratá pravá a dvanástim ľavá oblička. Stupeň TNM klasifikácie bol stanovený patológom a pohyboval sa od T1 po T3, Fuhrmanovej grading bol stanovený prostredníctvom imunohistochémie a pohyboval sa od G1 po G3 a angioinvázia bola pozitívna u 23 pacientov. Pacienti boli operovaný na Urologickej klinike Fakult­nej nemocnice v Martine. Zmeny expresie kaveolínu-1 sa študovali prostredníctvom metódy Western blot. Ako primárna protilátka proti kaveolínu-1 bola použitá anti-kaveolín-1. Primárna protilátka bola nariedená v pomere 1 : 1500 v 1% mlieku. Po primárnej protilátke sa membrána premývala v TBS-T (Tris-Buffered Saline Tween-20) a inkubovala sa so sekundárnou protilátkou značenou peroxidázou. Sekundárnou protilátkou proti kaveolín-1 bola anti-mouse IgG-HRP, nariedená v po­mere 1 : 10 000 v TBST. Blot sa exponoval na RTG film. Expozičný čas pre kaveolín-1 bol 60 minút. Autoluminogram proteínu sa spracoval v programe Optiquant (Packard Instruments). Hodnotila sa optická denzita škvŕn proteínu, pričom od tejto denzity sa odčíta denzita pozadia. V práci sa výsledky uvádzajú ako priemer ± stredná chyba priemeru (SEM). Na hodnotenie rozdielov sme použil nepárový Studentov t-test. Hodnoty p < 0,05 boli považované za signifikantné.

Výsledky

Sledovaním expresie cav-1 sme zaznamenali viditeľ­né zmeny v expresii kaveolínu 1 v tumorových tkanivách v porovnaní s kontrolnými tkanivami (obr. 1A). Vzorky označené ako KP (kontrola) a TP (tumor) boli od pacienta s diagnózou papilárny podtyp adenokarcinómu obličiek (PRCC). Expresia kaveolínu 1 bola zaznamenaná iba vo svetlobunkovom podtype RCC (obr. 1B). Tieto vzorky neboli ďalej použité v štatistickom vyhodnocovaní.

V tumorových tkanivách bolo zaznamenané zvýše­nie expresie kaveolínu 1 vzhľadom ku kontrole (tumor 1998 ± 423 %, kontrola 100 ± 50, p < 0,05) (obr. 2). Súbor pacientov bol rozdelený do štyroch skupín podľa TNM klasifikácie na štádiá T1a, T1b, T3a a T3b. Zaznamenali sme signifikantné zvýšenie expresie kaveolínu 1 v štá­diu T1a (tumor T1a 1595 ± 553, kontrola T1a 63 ± 31, p < 0,05) (obr. 3). Vzťah medzi zmenou expresie kaveo­línu 1 a stupňom Fuhrmanovej gradingu bola preukázateľná v štádiách G1 a G2 (G1 tumor 1932 ± 596, kontrola 42 ± 26, p < 0,05; G2 tumor 2284 ± 658, kontrola 101 ± 65, p < 0,05) (obr. 4). Zmeny expresie kaveolínu 1 sme porovnali s proliferačnou aktivitou (PCNA) jednotlivých pacientov. Zaznamenali sme sig­nifikantné zvýšenie expresie kaveolínu 1 u pacientov s proliferačnou aktivitou 10 % (obr. 5).

Diskusia

Výsledky uvedené v tejto práci boli získané na základe vyhodnotenia klinických údajov 42 pacientov s diagnózou adenokarcinómu obličiek. Metódou Wes­tern blot sme sledovali expresiu cav-1 v kontrolnom a tumorovom tkanive. Výsledky boli porovnané s TNM klasifikáciou a Guhrmanovej gradingom.

Kaveolíny sa zúčastňujú na patogenéze mnohých ľudských nádorov, ako napríklad epiteliálne nádory, rakovina pľúc, rakovina gastrointestinálneho traktu, prostaty, vaječníkov a RCC (8). Kľúčovým procesom nádorových buniek je migrácia buniek, ktorá je základným procesom angiogenézy a metastázovania (9). Je známe, že kaveolín 1 má funkciu tumor-supresora, ktorý inhibuje aktivitu mnohým proto­onkogénov. Veľa predchádzajúcich štúdií sledovalo nízku expresiu kaveolínu 1 v tumorových bunkách, čím potvrdili hypotézu kaveolínu 1 ako tumor-supresora (10). Naše výsledky však poukazujú na nadmernú produkciu kaveolínu 1 v tumorových tkanivách v porovnaní s kontrolným tkanivom. Záro­veň sme dokázali špecifickosť expresie kaveolínu 1 vo svetlobunkovom podtype RCC. Hypotézu tumor-supresora sme mohli preto vylúčiť. Wu a Terian poukazujú na nadmernú expresiu kaveolínu 1 pri rakovine prostaty. V procese metastázovania bola v častiach primárneho tumoru sledovaná nadmerná expresia kaveolínu 1 (11). Preto sa môžeme domnievať, že kaveolín 1 nemá v tomto prípade funkciu tumor-supresora, ale sa zúčastňuje na procese rastu nádorovej masy čomu nasvedčuje aj nadmerná expresia kaveo­línu 1 u pacientov so zvýšeným PCNA.

Porovnaním našich výsledkov s TNM klasifikáciou a Fuhrmanovej gradingom sme zaznamenali zmeny expresie kaveolínu 1 v jednotlivých stupňoch. Sledo­vali sme signifikantný nárast expresie kaveolínu 1 v tumorových tkanivách v stupni T1a TNM klasifikácie a v stupni G1 a G2 Fuhrmanovej gradingu v porovnaní s kontrolným tkanivom. Najväčšie rozdiely sme sledovali v T1a stupni TNM, preto by mohol kaveolín 1 slúžiť ako indikátor závažnosti ochorenia adeno­karcinómu obličiek.
Táto práca vznikla za podpory grantu VEGA 1/0103/09 a VEGA 1/0707/09.

LITERATÚRA

1.    VOGELYANG, N.J., STADLER, W.M.: Kidney cancer. Lancet, 9141, 1998, č. 352, s.1691-1696.
2.    STORKEL, S., EBLE, J.N., ADLAKHA, K., et al.: Classification of renal cell carcinoma. Workgroup No. 1. Union Internationale Contre le Cancer (UICC) and the American Joint Committee on Cancer (AJCC). Cancer (Phila), 80, 1997, č. 5, s. 987–989.
3.     RATHMELL, W.K., MARTZ, C.A., RINI, B.I.: Renal cell carcinoma. Curr Opin Oncol, 19, 2007, č. 3, s. 234-240.
4.    KURZCHALIA, T.V., PARTON, R.G.: Membrane microdomains and caveola. Curr Opin Cell Biol, 11, 1999, č. 4, s. 424-431.
5.     ROTHBERG, K.G., HEUSER, J.E., DONZELL, W.C., et al.: Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell, 68, 1992, č. 4, s. 673-682.
6.    ENGELMAN, J.A., ZHANG, X., GALBIATI, F., VOLONTE, D., SOTGIA, F., PESTELL, R.G., MINETTI, C., SCHERER, P.E., OKOMATA, T., LISANTI, M.P.: Molecular genetics of the caveolin gene family: implications for human cancers, diabetes, Alzheimer disease, and muscular dystrophy. Am.J.Hum. Genet., 63, 1998, č. 6, s. 1578-1587.
7.    COHEN, A.W., RAZANI, B., WANG, X.B., COMBS, T.P., WILLIAMS, T.M., SCHERER, P.E., LISANTI, M.P.: Caveolin-1-deficient mice show insulin resistance and defective insulin receptor protein expression in adipose tissue. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2003, č. 285,
s. C222-C235.
8.    WILLIAMS, T.M., CHEUNG, M.W., PARK, D.S., RAZANI, B., COHEN, A.W., MULLER, W.J., DI VIZIO, D., CHOPRA, N.G., PESTELL, R.G., LISANTI, M.P.: Loss of caveolin-1 gene expression acceleratesthe development of dysplastic mammary lesion in tumor- prone transgenic mice. Mol Biol Cell, 14, 2003, č. 3, s. 1027-1042.
9.    GÁLVEZ, B.G. et al. : Caveolae are a novel pathway for a membrane- type 1 matrix metalloproteinase traffic in human endothelial cells. Molecular Biology of the Cell, 15, 2004, č. 2, s. 678-687.
10.    ENGELMA, J.A., WYCOFF, C.C., YASUHARA, S., SONG, K.S., OKAMATA, T., LISANTI, M.P.: Recombinant expresion of caveolin-1 in oncogenically transformed cells abrogates anchorage-indepedent growth. J Biol. Chem., 272, 1997, č. 26, s. 16374-16381.
11.    WU, D., TERRIAN, D.M.: Regulation of caveolin 1 expression and secretion by a protein kinase C (PKC) epsilon signaling pathway in human prostate cancer cells. J Biol Chem, 277, 2002, č. 43, s. 40449-40455.

L. MÉSAROŠOVÁ, J. ŠVIHRA, S. FRAŇOVÁ, A. HRABOVSKÁ, P. KŘENEK, J. KYSELOVIČ, P. OCHODNICKÝ
Ústav farmakológie, Jesseniova lekárska fakulta UK, Martin
Urologická klinika fakultnej nemocnice UK, Martin
Katedra farmakológie a toxikológie, Farmaceutická fakulta UK, Bratislava

Summary

L. Mésarošová, J. Švihra, S. Fraňová, A. Hrabovská, P. Křenek, J. Kyselovič, P. Ochodnický

Role of caveolin 1 in proliferation process of clear cell renal cell carcinoma of kidney

Renal cell carcinoma is the most common malignant of the kidney. It accounts for 3% of all adult malignancies. The 20-30% of patients are often diagnosed with metastatic disease. Samples of tumor and healthy tissues obtained from patients by radical nephrectomy were used to determine the expression of caveolin 1 by Western blot. Changes of the expression level were correlated with TNM classification and Fuhrman nuclear grading of the tumors. Patients were devided in to the groups according the TNM classification and Fuhrman´s grading. We observed overexpresion of caveolin 1 in the stages T1a of TNM and G1, G2 of Fuhrman´s grading. Patients with 10% proliferation activity had high expression level of caveolin 1. Caveolin 1 may participate in the growth of tumors cell and angiogenesis and could be used as a biomarker of renal cell carcinoma.
Key words: renal cell carcinoma – caveolin 1- TNM classification – Fuhrman´s grading – PCNA.